梨支原体（Mycoplasma pirum，Mpi）因从HIV/AIDS人群体内成功分离，而被称为“艾滋病相关支原体”^[1]。因其具有侵袭黏膜细胞的特性，释放介质所致的局部炎症反应可致生殖道黏膜的破溃，使HIV更易侵入宿主细胞造成感染^{[2, 3]}。此外，HIV感染后破坏机体的免疫系统，造成更多支原体的机会性感染，从而加速AIDS病程发展及死亡。现有HIV/AIDS人群中支原体感染情况的流行病学研究数据尚不充分，而在支原体基因组学研究中尚缺乏Mpi全基因组序列。本研究旨在调查分析江苏省男性HIV/AIDS人群中Mpi的感染情况和危险因素，并首次对Mpi进行全基因组测序，为进一步研究HIV与支原体共感染及其对AIDS病程的影响机制提供依据。 对象与方法

1. 研究对象：2009－2011年4次横断面调查，分别纳入497例、317例、349例和677例调查者，剔除重复检测的250人，共纳入1 541例男性HIV/AIDS人群为研究对象。调查对象均经知情同意后进行问卷调查及相关生物样本采集。问卷调查包括人口学特征，行为学特征等信息。

2. 样本采集及相关指标检测方法：

（1）样本收集：用尿杯按要求收集与上次排尿间隔2 h以上的首段尿10～20 ml，转入尿液标本保存管，常温保存。编号登记（包括地区、姓名等信息），4 h内送实验室检测Mpi。采集患者全血5～6 ml于EDTA-K3抗凝管，并于4 h内送至江苏省疾病预防控制中心实验室，用于检测CD₄^＋T淋巴细胞。

（2）DNA提取：首段尿液经3 500 r/min离心15 min后，弃上清液，用1 ml生理盐水溶解沉淀，振荡混匀后取400 μl于0.5 m1离心管内，15 000 r/min离心5 min，弃上清，加裂解液30 μl，充分混匀后置入55 ℃ 水浴保温60 min，后置入95 ℃ 保温10 min，10 000 r/min离心30 s，上清即为PCR扩增用模板液。所用裂解液由KCl溶液（1 mol/L）5.0 ml、MgCl2溶液 （1 mol/L） 0.25 ml、 Tris-HCl 缓冲液（1 mol/L，pH 8.0）1.5 ml、20%Tween-20 2.5 ml，加双蒸水定容至100 ml所配制。应用前裂解液与蛋白酶K（200 μg/ml）以50 ∶ 2的体积混合。

（3）PCR检测Mpi：采用巢式PCR对Mpi检测，相关引物见表 1。反应体系最终为50 μl，含PCR buffer（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，50 mmol/L KCl，0.1%Triton X-100），1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，引物各0.5 μmol/L，1 U的Taq酶及5 μl样本。 PCR扩增条件：两次PCR扩增热循环参数均为94 ℃预变性2 min，然后按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共40个循环，最后一个循环72 ℃延长至5 min。每次检测均设立阳性、阴性对照。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳并经全自动凝胶成像仪观察结果。

表 1 外套引物及特异性引物

表选项

（4）CD₄^＋T淋巴细胞计数：TruCOUNT绝对计数管中准确加入20 μl MultiTEST四色试剂和50 μl全血，充分混匀，室温阴暗处放置15 min；加入450 μl FACS溶血液，充分混匀，室温阴暗处放置30 min向另外3个TruCOUNT绝对计数管中分别加入50 μl TruCOUNT Control Beads（low/medium/high）作为绝对计数质控；运行MultiSET程序上机检测。

（5）Mpi标准株DNA提取及基因测序：采用改良SP-4培养基，在37 ℃、5%CO₂培养箱中对Mpi（ATCC25960）的冻干菌株进行复苏传代和培养增菌，收获最佳生长期的阳性菌液。培养中均设置单纯培养基空白对照。上述菌液按照QIAGEN试剂盒说明书提取基因组DNA。采用Illumina Hiseq 2000平台测序，经数据清理后，使用短序列拼接软件SOAPdenovo拼接组装。

3. 统计学分析：采用EpiData 3.01软件录入流调问卷，SPSS 19.0软件进行统计分析，运用χ²检测和logistic回归进行单因素和多因素分析，检验水准α＝0.05。 结 果

1．HIV/AIDS人群特征及Mpi感染状况：

（1）人群特征：本研究共纳入1 541名研究对象，851名（55.2%）处于HIV感染阶段，690名（44.8%）已经发展为AIDS。平均年龄为（39.20±11.28）岁，见表 2。

表 2 调查对象人群特征

表选项

（2） Mpi感染与CD₄^＋T淋巴细胞水平的关联性：该人群Mpi 感染率为15.4%（95%CI：14%～17%）。4次横断面调查Mpi感染率分别为16.3%（95%CI：13%～19%），21.5%（95%CI：16%～27%），12.9%（95%CI：9%～18%）及13.9%（95%CI：10%～16%），存在一定程度的变化，且差异具有统计学意义（χ²＝11.844，P＜0.05）。按照CD₄^＋T淋巴细胞计数350 cell/μl分组比较Mpi感染情况，结果显示：CD₄^＋T淋巴细胞计数≤350 cell/μl组的Mpi感染率为18.7%，＞350 cell/μl组 Mpi感染率为11.3%，两组Mpi感染情况存在差异，且具有统计学意义（χ²＝16.173，P＜0.05），由此提示CD₄^＋T淋巴细胞计数≤350 cell/μl与Mpi感染密切相关。

（3）Mpi感染的危险因素分析：利用非条件logistic回归对Mpi感染因素进行分析，以单纯Mpi感染者Y＝1，无支原体感染者Y＝0，分别纳入年龄组、教育程度、婚姻状况、感染途径等因素，分析影响因素。结果显示：与接受HAART组比较，未接受HAART是支原体感染的危险因素（OR＝1.344，95%CI：1.008～1.792）；CD₄^＋T淋巴细胞计数＞350 cell/μl可降低感染支原体的风险（OR＝0.600，95%CI：0.444～0.810），见表 3。

表 3 logistic回归分析梨支原体的感染因素

表选项

2. Mpi全基因组测序：经Illumina Hiseq 2000平台测序得到Mpi基因组为850 704 bp，GC含量为24.21%。通过基因预测方法获取测序菌株基因组的组成情况，样品Mpi的基因组含有708个基因，总长度为734 085 bp，平均长度1 037 bp，占基因组全长的86.29%。 讨 论

目前，我国支原体感染还未被列入性病门诊常规检测项目，且缺乏支原体的快速诊断技术，仅限于病症上的描述和报告。本研究首次对江苏省男性HIV/AIDS人群Mpi感染情况进行了评价。经过4次横断面调查，Mpi感染率为15.4%。HIV/AIDS人群存在免疫缺陷，更易感染支原体^[4]。有研究显示支原体能够促进HIV复制，将Mpi添加到感染了HIV的外周血单核细胞后，病毒复制程度增加^[5]。

在1 541名研究对象中，一半以上年龄低于40岁，有54.0%的调查对象文化程度较低。以往研究表明，男男性行为在其他艾滋病相关支原体感染中是危险因素^{[6, 7]}，但本次研究中对Mpi感染率影响无统计学差异，需要扩大样本量进一步研究两者之间的联系。调查对象中，未接受HAART的人群感染Mpi的风险更大，较高的CD₄^＋T淋巴细胞水平可降低Mpi感染，这可能由于接受HAART会使CD₄^＋T淋巴细胞维持在稳定水平，提高患者免疫力，从而降低Mpi感染。因此，应对该人群进行合理有效的抗病毒治疗^{[8, 9]}。

本课题组先前已对Mpi 16SrRNA基因片段序列分析^[10]，此次本研究对Mpi标准株进行测序，首次获得Mpi全基因组序列并提交NCBI数据库（注册号：AZHZ00000001），为进一步研究病原菌与宿主互作和病原菌的抗性机制筛选靶标提供数据信息。

本研究提示：男性HIV/AIDS人群中Mpi感染率较高，但横断面研究存在一定的局限性。今后将开展相关前瞻性队列研究，更好地评估该人群中艾滋病相关支原体感染情况及其在AIDS疾病进程中的作用，进一步确定HIV/AIDS人群中支原体感染和HIV感染的因果关系，并且确定支原体感染在HIV传播中的临床意义。现阶段已经把Mpi标准株基因组测序完成并进行了初步的基因比对和功能注释分析，今后将继续探求其致病功能基因，为研究其致病机制提供科学依据。