手足口病（HFMD）是由人类肠道病毒引起的一种常见传染病，主要病原是肠道病毒71 型（EV71）和柯萨奇病毒A组16 型（Cox A16）。但近年来，该病病原谱逐渐发生了变化，非EV71 和非Cox A16 的其他肠道病毒比例逐渐增加^{[1, 2]}，而且导致重症或死亡病例发生^[3]。2013 年宁夏回族自治区（宁夏）共报告HFMD病例6 069 例，实验室诊断病例796 例，其中104 例EV71 型，412 例Cox A16，其他肠道病毒280例。为了解肠道病毒型别构成情况和常见病原体的基因特征，本研究对2013 年分离到的柯萨奇病毒A组10 型（Cox A10）毒株进行了VP1 区基因测序和特征分析。

1. 标本来源：2013 年宁夏各市（县）共采集HFMD 临床病例标本1 155 份，其中粪便标本272份、咽拭子883 份。

2. 病毒核酸提取和鉴定：标本按照国家《手足口病防治指南》（2009 版）处理后，吸取200 μl 上清液提取病毒RNA，采用硕世生物科技公司生产的EV71、Cox A16 和肠道病毒通用检测试剂进行核酸检测，步骤及条件参见试剂说明书。

3. 病毒分离：取200 μl 核酸检测阳性标本上清液，接种至长满单层、形态良好的RD细胞，置36 ℃培养箱内，连续7 d 观察细胞病变（CPE），当CPE≥75%时收获病毒，并置于-20 ℃保存；若连续传2 代仍无CPE出现，则判为阴性。

4. RT-PCR检测：病毒分离阳性分离物反复冻融后，提取病毒RNA，根据参考文献，使用兼并引物进行肠道病毒VP1 区RT-PCR 扩增^[4]。扩增试剂为北京全式金生物技术有限公司一步法RT-PCR 试剂盒，反应条件：42 ℃ 45 min，95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，40 个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

5. 序列测定与分析：电泳阳性PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行核苷酸序列测定。测序结果利用SeqMan 软件进行拼接，拼接后的序列进行BLAST 同源性检索。对鉴定为CoxA10 的宁夏株与各亚型代表株利用MegAlign 软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析，利用Mega 6.0 软件采用邻接法构建系统发生树，建树的可靠性通过1 000 bootstrap 来评估。用于同源性分析和构建系统发生树的参比序列均来自GenBank。

1. HFMD病原构成：2013 年共采集临床HFMD病例标本1 155 份，经real-time PCR 检测，阳性标本为796 份，阳性率为68.92%；其中EV71、Cox A16 和其他肠道病毒分别为104、412 和280 份，所占比例分别为13.06%、51.76%和35.18%。

2. 其他肠道病毒的分离和鉴定：使用RD 细胞从280 份标本中共分离到其他肠道病毒28 株，通过对其VP1 区基因测序和BLAST分析，共鉴定出4 个基因型别，其中6 株（21.43% ）Cox A10，4 株（14.29% ）Cox A4，5 株（17.86% ）Cox A6，2 株（7.14%）Cox A14，未分型肠道病毒11 株（39.29%）。

3. Cox A10 宁夏株VP1 区核苷酸、氨基酸序列分析：对6 株Cox A10 宁夏株及从GenBank 中检索到的Cox A10 原型株（Kowalik/USA/1950）和其他地区流行株进行VP1 区核苷酸和氨基酸序列同源性分析^[3]。发现6 株Cox A10 宁夏株间具有较高的同源性，相互间核苷酸同源性为97.0%～99.8%，氨基酸同源性为99.0%～99.7%。与A、B、C、D各型别代表株的同源性比较发现，6 株Cox A10 宁夏株与C型代表株的核苷酸和氨基酸同源性最高，分别为94.4%～98.9%和98.0%～99.7%（表 1）。

表 1 6 株Cox A10 宁夏株与各基因型代表株间VP1 区核苷酸和氨基酸序列同源性分析（%）

表选项

4. Cox A10 宁夏株亲缘进化分析：VP1 区基因系统发生树分析显示，Cox A10 被划分为4 个基因型（A～D），我国目前分离到的Cox A10 毒株均属于B基因型和C基因型，其中B基因型主要包括山东省2004－2008 年分离株，C基因型主要包括山东省和江苏省2008－2012 年分离株和河北省2013 年分离株，A基因型仅有美国一株Kowalik 原型株，与其他型别同源性差别较大，D基因型主要包括国外一些国家分离到的毒株，如西班牙2008 年分离株、法国2010 年分离株和俄罗斯2010 年分离株。从基因进化关系来看，2009 年以后我国流行的Cox A10 主要以C基因型为主。本次分离到的6 株宁夏株与C型代表株处于同一分支，属于C型Cox A10，与2009 年以后我国其他地区流行型别一致^{[3, 5]}。6 株宁夏株之间，银川地区分离株（YC13-075T和YC13-075T3）与石嘴山地区分离株（SZS13-012T、SZS13-025T 和SZS13-025T）同源差距较大，具有明显的地域性，形成了不同支系，表明有多条传播链在宁夏地区共循环。

除了EV71 和Cox A16 之外，近年来Cox A10、Cox A6 和Cox B3 等病毒也逐渐演变成为HFMD的常见病原体^{[1, 6, 7, 8, 9]}。新加坡学者在2009 年提出^[10]，Cox A10 是除EV71 外可单独引起重症病例的病原体，在疾病防控中，与EV71 和Cox A16 地位同等重要。

本次研究使用兼并引物对宁夏非EV71 和非Cox A16肠道病毒进行了RT-PCR 鉴定，结果显示，在宁夏HFMD病例的病原中，Cox A10 构成了除EV71 和Cox A16 之外的最主要的病原体，与我国河北、广东、山东等省份监测结果一致^{[3, 5, 11, 12]}。针对2013 年我国各省份HFMD 病原中其他肠道病毒所占比例大幅度增高的现象，希望引起有关部门的重视。

通过对病毒基因进化和同源性分析发现，Cox A10 病毒划分为4 个基因型（A～D），与Tian 等^[3]研究结果一致。我国流行Cox A10 具有明显的时间进化特征，2004－2008 年主要以B 基因型流行为主，2009年以后主要以C 基因型为主。根据不同年度毒株进化关系来看，相比较2008 － 2010 年山东、江苏等地流行的Cox A10，宁夏流行株与2012 年河北省石家庄市流行株具有更高的同源性，说明宁夏地区流行的Cox A10 与国内同一时期流行Cox A10 一致。但通过病毒系统进化分析发现，宁夏株进化又相对独立，与同源性最高的石家庄株相比，核苷酸同源性为97.0%～98.9%，氨基酸同源性为99.0%～99.7%，形成了较为独立的进化分支，说明可能宁夏地区性流行时间较长，为更加清楚地阐述其在宁夏地区的流行情况，需要做好连续性监测。

6 株宁夏株之间也具有明显的地域特征，2 株银川分离株与4 株石嘴山分离株形成了两支明显的传播链Lineage 1 和Lineage 2（图 1）。同一传播链毒株之间核苷酸同源性较高，Lineage 1 毒株间的同源性为99.3% ～99.8% ，Lineage 2 毒株间的同源性为99.3% ；不同传播链毒株之间同源性也有差异，Lineage 1 和Lineage 2 毒株间的同源性为97.0%～97.3%。而且不同地区之间毒株形成了两支明显的传播链。表明宁夏流行Cox A10 具有明显的地域性，存在至少两条传播链发生共循环。

图 1 6株宁夏Cox A10分离株与各型代表株的VP1基因（894nt）系统发生树

图选项

引起HFMD的病原体种类繁多，其主导病原体在不断地发生着变化。随着主要引起HFMD病原体——EV71 和Cox A16 的广泛流行，其通过自然感染而建立的免疫屏障达到一定的保护水平后，另外一种病原体的危害性会凸显出来。因此，加强不同时间、不同地区其他肠道病毒的监测，全面了解其基因进化特征和遗传信息，对于当地HFMD的防控具有重要的意义。