大肠埃希菌（E. coli）常作为条件致病菌引起尿道炎、败血症、肺炎和新生儿脑膜炎等疾病^[1]。临床上通常采用β-内酰胺类头孢菌素治疗E. coli感染性疾病，但该菌对β-内酰胺类抗生素有较高耐药率，其机制主要是产生β-内酰胺酶^{[2, 3, 4]}。β-内酰胺酶有多种类型，其中以KPC、TEM、CTX-M、SHV和OXA较为常见，但不同地区E. coli的优势β-内酰胺酶基因型有一定差异^{[5, 6, 7, 8]}。近年发现，通常由组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和应答调节蛋白（response regulatory protein，RRP）组成的细菌二元信号系统（two-component signaling system，TCSS）与细菌耐药性密切相关^{[9, 10]}。为此本研究对分离自浙江省部分地区的E. coli临床菌株检测β-内酰胺类抗生素耐药性及其β-内酰胺酶基因型，探讨β-内酰胺类抗生素诱导细菌β-内酰胺酶基因表达以及HK抑制剂氯氰碘柳胺（closantel，CLO）抑制细菌耐药性的作用，以了解当地优势β-内酰胺酶基因型及其携带模式，也可为抗细菌耐药新药研发提供依据。 材料与方法

1. 菌株来源及鉴定：462株E. coli临床分离菌株来自浙江省杭州、宁波和金华地区8家医院的下呼吸道感染病例痰液、感染性胸膜炎病例胸水、新生儿脑膜炎脑脊液、菌血症或败血症病例外周血、泌尿道重度感染病例尿液。上述菌株均经VITEK Compact 2型全自动细菌检测分析系统及其配套的细菌鉴定卡GNI鉴定。质控菌株为E. coli ATCC25922株由浙江大学医学院病原生物学系严杰教授惠赠。

2. 药物敏感试验：采用美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）推荐的微量稀释法检测上述临床菌株对青霉素（CPN）、氨苄青霉素（AMP）、头孢西丁（CFX）、头孢噻肟（CTX）、头孢他啶（CAZ）的最低抑菌浓度（MIC）^[11]。

3. β-内酰胺酶及其基因检测：采用NCCLS 推荐的纸片法β-内酰胺酶确证试验^[11]。将E. coli耐药菌株涂布于M-H琼脂平板，贴上CAZ、CAZ/克拉维酸（CA）或CTX、CTX/CA纸片（bioMerieux），35 ℃培养24 h后观察结果，若复合药物纸片抑菌环直径较相应单一药物纸片抑菌环直径≥5 mm为β-内酰胺酶确证试验阳性。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen）提取E. coli耐药菌株基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度^[12]。根据文献报道的KPC、TEM、CTX-M、SHV和OXA基因通用引物序列^{[13, 14, 15, 16, 17]}，委托上海Invitrogen公司合成各引物（表 1）。采用高保真PCR试剂盒（TaKaRa）检测各菌株β-内酰胺酶基因。PCR反应总体积为100 μl，内含2.5 mol/L dNTP、200 nmol/L各引物、20 mol/L MgCl2、2.5 U EX-Taq DNA聚合酶、100 ng DNA模板和1×PCR缓冲液（pH 8.3）。PCR参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃或55 ℃ 30 s、72 ℃ 120 s，30个循环；72 ℃ 10 min。采用溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，KPC、TEM、CTX-M、SHV和OXA基因扩增片段分别为1 050、972、882、1 017和441 bp。采用PCR产物纯化试剂盒（TaKaRa）回收各靶基因扩增片段，采用T-A克隆试剂盒（TaKaRa）将其克隆至pMD-19T质粒中。重组pMD-19T电转化入E. coli DH5α（Invitrogen），然后在含AMP（Sigma）LB培养液（bioMerieux）中扩增。采用质粒提取试剂盒（Axygen）提取E. coli DH5α中扩增的重组pMD-19T，委托上海Invitrogen公司测序，采用BLAST软件将测序结果与GenBank中相应序列进行比较，确定其β-内酰胺酶基因型^[12]。

4. E-test：采用法国bioMerieux公司CTX和CPN纸片及其实验流程，以获得携带β-内酰胺酶单基因耐药菌株更精确的MIC。

5. 抗生素作用前后β-内酰胺酶基因mRNA检测：用1/4 MIC头孢噻肟或青霉素（Sigma）分别作用于89株携带β-内酰胺酶单基因耐药菌株0.5、1、2和4 h，8 000 r/min离心10 min（4 ℃），细菌沉淀用PBS洗涤、离心3次。取细菌沉淀用TRIzol试剂（Sigma）提取总RNA，分光光度法测定其浓度和纯度^[12]。采用反转录试剂盒（TaKaRa）将等量各细菌总RNA反转录后获得cDNA。KPC、TEM、CTX-M、SHV、OXA基因以及作为内参照的16S rRNA基因实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）引物见表 1，引物由上海Invitrogen公司合成。采用SYBR Premix Ex-TaqTM荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa）及ABI-7500型实时荧光定量PCR仪，对各反转录产物进行扩增。反应体系20 μl，引物浓度为0.2 μmol/L，2 μl反转录产物为模板。反应参数：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40个循环。获得的qRT-PCR数据用REST2005软件及ΔΔCT相对定量法进行定量，并与抗生素作用前β-内酰胺酶基因mRNA水平进行比较^[18]。采用E. coli 16S RNA基因作为内参照（表 1）^[17]。

表 1 PCR和qRT-PCR引物

表选项

6. CLO毒性试验：100株耐药菌株中加入25、50、100、250或500 μg/ml的CLO（Sigma）后37 ℃作用0.5 h^[19]，然后分别采用微量稀释法及NCCLS介绍的最低杀菌浓度（MBC）检测方法分别测定CLO对E. coli的MIC和MBC^[11]。以CLO未作用的菌株作为对照。

7. CLO作用前后抗生素诱导β-内酰胺酶基因mRNA水平检测：89株携带β-内酰胺酶单基因的耐药菌株用25、50、100、250或500 μg/ml的CLO（Sigma）37 ℃作用0.5 h。上述抗生素作用前后β-内酰胺酶基因mRNA检测显示，除KPC基因外，上述1/4 MIC头孢噻肟或青霉素作用1、2或4 h时TEM、CTX-M、SHV和OXA基因mRNA升高水平相似，故各菌株CLO预处理后加入1/4 MIC的CTX或CPN后37 ℃作用1 h，然后采用上述qRT-PCR检测细菌KPC、TEM、CTX-M、SHV和OXA基因mRNA水平变化。同样以CLO未作用菌株作为对照。

8. CLO抑制β-内酰胺酶表达及协同抑菌作用的检测：根据上述CLO毒性试验及CLO相关qRT-PCR检测结果，先用100 μg/ml的CLO（Sigma）37 ℃作用耐药菌株0.5 h，然后用上述微量稀释法和β-内酰胺酶确证试验分别检测5种β-内酰胺类抗生素对细菌MIC及β-内酰胺酶活性变化，检测结果与CLO未作用菌株进行比较。以E. coli ATCC25922为质控菌株。

9. 统计学分析：采用SPSS 13.0软件分别对细菌耐药率、β-内酰胺酶及其基因检出率、β-内酰胺酶mRNA水平进行χ²和t检验，P＜0.01为差异有统计学意义。 结 果

1. 耐药菌株β-内酰胺酶检测：采用微量稀释法测定，462株E. coli中有61.7%（285/462）的菌株对CPN、AMP、CFX、CTX和CAZ耐药。285株β-内酰胺类抗生素耐药菌株中有93.3%（266/285）的菌株β-内酰胺酶确证试验为阳性，采用PCR，285株β-内酰胺类抗生素耐药菌株可检出KPC、TEM、SHV、CTX-M、 SHV和/或OXA基因（图 1），与GenBanK中公布的相应β-内酰胺酶基因序列比较，其序列相似性高达99.6%～100%。

注：M：DNA Marker（TaKaRa）； 1：空白对照； 2～6：分别为KPC（1 050 bp）、TEM（972 bp）、CTX-M（882 bp）、SHV（1 017 bp）和OXA（441 bp）基因扩增条带图 1 E. coli临床分离株的β-内酰胺酶基因扩增条带

图选项

2. CLO作用后细菌耐药性和β-内酰胺酶阳性率变化：CLO对E. coli的MIC和MBC均＞500 μg/ml。与100 μg/ml CLO作用前比较，285株耐药菌株经CLO作用后有82.8%（236株）、84.9%（242株）、83.5%（238株）、85.3%（243株）和85.6%（244株）菌株转为对CPN、AMP、CFX、CTX和CAZ敏感（P＜0.01）；β-内酰胺酶确证试验阳性率也从CLO作用前的95.1%（271/285）降低至作用后的16.1%（46/285）（P＜0.01）。见表 2。

表 2 CLO作用后E. coli耐药性和β-内酰胺酶阳性率变化

表选项

3. 优势β-内酰胺酶基因型及其携带模式：285株β-内酰胺类抗生素耐药菌株中1.8%（5/285）的菌株检出KPC基因、83.2%（237/285）检出TEM基因、75.1%（214/285）检出CTX-M 基因、10.2%（29/285）检出SHV基因、1.4%（4/285）检出OXA基因，TEM和CTX-M基因检出率显著高于KPC、SHV和OXA基因（P＜0.01）。31.2%（89/285）菌株携带KPC、TEM、CTX-M、SHV或OXA单基因，68.8%（196/285）菌株携带两种以上β-内酰胺酶基因，其检出率显著高于携带β-内酰胺酶单基因菌株（P＜0.01）。携带两种以上β-内酰胺酶基因菌株中，89.3%（175/196）菌株同时携带TEM和CTX-M基因（TEM＋CTX-M），明显高于TEM＋SHV（5.6%，11/196）、CTX-M＋OXA（0.5%，1/196）、SHV＋OXA（0.5%，1/196）和TEM＋CTX-M＋SHV（4.1%，8/196）基因携带模式（P＜0.01），见表 3。

表 3 285株E. coli耐药菌β-内酰胺酶基因类型及携带模式

表选项

4. 低浓度抗生素对β-内酰胺酶mRNA水平的影响：与抗生素作用前比较，89株携带TEM、CTX-M、SHV或OXA单基因的耐药菌株经1/4 MIC 的CTX或CPN作用0.5 h后，TEM-mRNA、CTX-M-mRNA、SHV-mRNA和OXA-mRNA水平均显著提高（P＜0.01），并在作用1或2 h时达到峰值，但KPC-mRNA无明显变化（图 2）。

注：携带KPC、TEM、CTX-M、SHV和OXA β-内酰胺酶单基因的E. coli分别为5、43、30、9和2株； a 与1/4 MIC的CTX或CPN未作用菌株靶基因mRNA水平比较P＜0.01图 2 1/4 MIC 的CTX和CPN诱导β-内酰胺酶基因转录效果

图选项

5. CLO抑制抗生素诱导β-内酰胺酶mRNA升高的作用：89株携带TEM、CTX-M、SHV或OXA单基因耐药菌株经采用浓度为50～500 μg/ml CLO作用后，明显抑制了上述1/4 MIC 的CTX或CPN可诱导细菌TEM-mRNA、CTX-M-mRNA、SHV-mRNA和OXA-mRNA水平升高现象（P＜0.01），但对KPC-mRNA无明显影响（图 3）。

注：携带TEM、CTX-M、SHV和OXAβ-内酰胺酶单基因的E. coli分别为43、30、9和2株；a与1/4MIC的CTX或CPN未作用菌株靶基因 mRNA水平比较P＜0.01；b与CLO未预处理、1/4MIC的CTX或CPN作用菌株靶基因mRNA水平比较P＜0.01图 3 CLO抑制CTX和CPN诱导β-内酰胺酶mRNA升高的作用

图选项

β-内酰胺酶根据作用机制不同可分为丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶^[6]。而根据水解抗生素的不同，β-内酰胺酶又可分为广谱（broad-spectrum）和超广谱（extended-spectrum）两类，TEM-1、TEM-2和SHV-1属前者，可使细菌对青霉素类和一代头孢菌素头孢唑林（cefazolin）耐药，其余TEM和SHV以及KPC、CTX-M、OXA为后者，可使细菌耐药谱扩展至二代及以上头孢菌素和氨曲南（aztreonam）^{[5, 13]}。

E. coli可产生多种广谱和超广谱β-内酰胺酶，且不同地区菌株优势β-内酰胺酶基因型有一定差异，如TEM和SHV型流行于北美和西欧、CTX-M型多见于东欧和亚洲及南美^{[2, 5, 7, 20]}。我国临床分离菌株β-内酰胺基因型，广东地区以CTX-M型为主，山西地区常见TEM型^{[3, 4, 21]}。本研究462株临床菌株中，61.7%对多种青霉素类和头孢菌素类抗生素耐药，耐药率与国内其他地区相似^{[3, 4]}；285株耐药菌株中，分别有83.2%和75.1%的菌株检出TEM和CTX-M基因，远高于SHV（10.2%）、KPC（1.8%）和OXA（1.4%）基因（P＜0.01），表明TEM和CTX-M基因均为浙江地区E. coli的优势β-内酰胺酶基因型。此外，285株耐药菌株中，68.8%的菌株携带两种以上β-内酰胺酶基因，其中64.2%菌株同时携带TEM和CTX-M基因（61.4%为TEM＋CTX-M，2.8%为TEM＋CTX-M＋SHV），表明TEM＋CTX-M是浙江地区E. coli耐药菌株β-内酰胺酶基因主要携带模式。

临床上常将β-内酰胺酶抑制剂与头孢菌素联合应用，治疗β-内酰胺类抗生素耐药菌株感染性疾病，但一些抑制剂可与β-内酰胺酶结合使之失活，不能抑制其表达^{[22, 23]}。业已证明，细菌HK胞外区与环境信号分子结合后发生变构，从而将信号传入胞内并使胞内区激酶催化位点中组氨酸被ATP磷酸化激活，RRP接受HK传递的磷酰基团后也随之活化，具备了与靶基因启动子结合并调控其表达的能力，若HK被抑制或失活，细菌无法对信号分子作出反应^[9]。CLO可特异与细菌HK胞内酶催化区结合，引起HK分子变构、磷酸化障碍而失活，故CLO成为目前实验中常用的细菌HK特异性抑制剂^[24]。β-内酰胺类抗生素主要有头孢菌素和青霉素两大类，本研究选择CTX和CPN。为防止不同β-内酰胺酶基因之间可能的干扰，试验中选择携带TEM、CTX-M、SHV或OXA单基因的耐药菌株。与真核细胞不同，原核细胞仅能在转录水平调控基因表达，故mRNA水平可直接反映基因的表达水平^[10]。为了避免较高浓度抗生素时因细菌生长抑制而影响靶基因表达，还采用1/4 MIC的CTX或CPN以探讨其诱导β-内酰胺酶基因mRNA水平升高以及CLO抑制该mRNA升高的作用。qRT-PCR结果显示，在1/4 MIC的CTX或CPN作用下，TEM、CTX-M、SHV和OXA基因mRNA水平迅速显著升高，但可被50～500 μg/ml 的CLO抑制，提示低浓度CTX或CPN可能作为外源性信号分子经HK相关TCSS诱导E. coli β-内酰胺酶基因表达。然而，该剂量的CTX或CPN均未显示出可诱导KPC基因mRNA升高的作用，提示这些抗生素可能不是诱导KPC基因表达的外源性信号分子。

为了排除CLO对E. coli毒性而导致β-内酰胺酶基因mRNA水平降低，本研究还检测了CLO对E. coli的MIC和MBC，结果显示25～500 μg/ml的 CLO均无抑菌或杀菌作用。此外，药敏试验和β-内酰胺酶确证试验表明，经100 μg/ml CLO作用后82.8%～85.6%的耐药菌株转为对5种β-内酰胺类抗生素敏感，β-内酰胺酶检出率也从95.1%降至16.1%，不仅提示CLO具有协同β-内酰胺类抗生素抑菌的作用，同时也从蛋白水平上证实CLO可抑制E. coli 的β-内酰胺酶基因表达。