中华绒螯蟹（大闸蟹）是我国一种重要的经济蟹类。在过去数十年中，随着人工养殖技术的提高，我国中华绒螯蟹年产量和养殖面积不断增加^{[1, 2]}，已经成为我国日常消费的食品之一。然而，中华绒螯蟹人工养殖所带来的食品安全问题一直不断地引起公众的关注和担心，其主要围绕养殖过程中是否存在抗生素和激素滥用，市场上销售的螃蟹是否存在抗生素和激素残留和残留可能带来的健康风险^[3]。

上海是我国螃蟹消费的主要城市之一，其市售螃蟹抗生素和激素残留状况不仅直接关系到上海地区食品安全问题，而且在一定程度上也是我国螃蟹抗生素和激素残留状况的缩影。我国农业部规定部分抗生素可以在水产养殖业中用来治疗和预防疾病，但需要严格按照规定使用，防止抗生素在水产品中残留或残留超过最大残留限量，而在水产业中禁止使用激素^{[4, 5, 6]}。但是目前关于螃蟹中抗生素和激素残留水平的研究很少，而且仅涉及抗生素或激素中的一类或几类，难以对抗生素和激素残留水平做出合理评价^{[7, 8]}。本研究的目的是筛查上海市市售中华绒螯蟹中6大类别的13种抗生素和7种内源性和人工合成性激素的残留水平，以期评价其健康风险。 材料与方法

1. 样品来源、处理与保存：2014年11－12月从上海市徐汇区和长宁区的6个菜市场和2个超市，采用方便采样法分6次收集56只原产地为太湖或阳澄湖的成年中华绒螯蟹，体重120～250 g，其中27只雄蟹，29只雌蟹。蟹购买后，送至实验室，用自来水刷洗干净，将其纵向等份切成两半后，取出体腔内所有内脏（包括蟹黄和蟹膏），剧烈搅拌混匀；取出蟹躯干和肢体肌肉，剪碎混匀；如样品不能立即分析，于-80 ℃避光保存。

2. 调查方法：

（1）仪器与试剂：美国Waters公司HLB固相萃取小柱（规格为60 mg/3 ml）、ACQUITY超高效液相色谱仪和SYNAPTG2高分辨率四极杆/飞行时间质谱仪；美国Supelco公司24位固相萃取仪；杭州奥盛公司KD200氮气吹扫仪。共筛查13种抗生素和7种性激素：前者包括4种喹诺酮类抗生素（环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和氧氟沙星）、3种磺胺类抗生素（磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺甲恶唑）、2种四环素类抗生素（四环素和土霉素）、2种酰胺醇类抗生素（甲砜霉素和氯霉素）、1种大环内酯类抗生素（阿奇霉素）和1种磺胺增效剂（甲氧苄啶）；后者包括4种内源性性激素（孕酮、睾酮、β-雌二醇和雌酮）和3种合成性激素（甲基睾酮、去甲雄三烯醇酮和己烯雌酚）。13种同位素内标包括四环素-d₆、环丙沙星-d₈、恩诺沙星-d₅、阿奇霉素-d₃、磺胺嘧啶-s¹³C₆、磺胺甲恶唑-d₄、甲氧苄啶-d₃、氧氟沙星-d₃、磺胺二甲嘧啶-d₄、氯霉素-d₅、孕酮-d₉、睾酮-s¹³C₃和β-雌二醇-d₃。全部标准品和同位素标准品均购买于德国Dr公司或美国Sigma公司。

（2）样品前处理：准确称取混匀的内脏和肌肉样品各1.00 g，加入同位素内标标准溶液，用10 ml乙腈提取，离心；取4 ml乙腈提取液，用4 ml石油醚萃取；除去上层石油醚后，下层乙腈提取液在45 ℃加热下用弱氮气流吹扫浓缩至近干，残留物用2 ml 25%甲醇溶液复溶。复溶液经HLB固相萃取小柱净化后，用2 ml含有1%甲酸的乙腈洗脱。取1 ml洗脱液，弱氮气流吹扫浓缩至干，用400 μl 20%甲醇溶液复溶后，用于抗生素分析；余下的1 ml洗脱液，在弱氮气流吹扫浓缩至干，丹酰氯衍生化后，用于激素分析。丹酰氯衍生化过程：向浓缩至干的洗脱液残留物中加入1 mg/ml丹酰氯丙酮溶液和100 mmol/L碳酸氢钠缓冲液（pH＝10）各200 μl，漩涡1 min，在60 ℃下衍生10 min，冷却至室温后进样分析^[9]。

（3）色谱和质谱联用分析：采用UPLC HSS T₃色谱柱（美国Waters，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分离抗生素。采用UPLC BEH C₁₈色谱柱（美国Waters，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离激素。对于正离子模式下分析的抗生素和激素，采用含0.1%甲酸的水和甲醇作为流动相。对于负离子模式下分析的抗生素，采用水和乙腈作为流动相。2种分析模式均采用梯度洗脱，流动相流速均为0.3 ml/min，柱温均为45 ℃，进样体积均为10 μl。采用电喷雾离子源（ESI）离子化待测物。正离子模式参数：毛细管电压为2.8 kV，锥孔电压为45 V，提取锥电压为4 V，离子源温度为110 ℃，锥孔气流量为40 L/h，脱溶剂气温度为400 ℃，脱溶剂气流量为1 000 L/h；负离子模式参数设置除毛细管电压为2.6 kV外，其余与上述相同。一级质谱模式和二级质谱模式质量扫描范围为50～1 000 Da，扫描时间为0.2 s。二级质谱碰撞气为氩气，所需碰撞能量在17～39 eV之间。除氯霉素和甲砜霉素在阴离子模式下分析外，其余抗生素和全部激素均在阳离子模式下分析。

（4）定性和定量方法：在一级质谱模式下，用保留时间和分子离子精确质量数对待测物进行定性。 如果发现阳性样本，用二级质谱获得的子离子丰度比和精确质量数进一步确证。采用同位素内标法进行定量，一级质谱模式下的母离子色谱峰作为定量离子。以母离子色谱峰面积与对应内标母离子色谱峰面积之比乘以内标质量浓度（ng/ml）为纵坐标，各待测物质量浓度（ng/ml）为横坐标绘制内标法校准曲线。睾酮-s¹³C₃用作睾酮、甲基睾酮和去甲雄三烯醇酮的内标，β-雌二醇-d₃用作β-雌二醇、己烯雌酚和雌酮的内标，四环素-d₆用作四环素和土霉素的内标，氯霉素-d₅用作氯霉素和甲砜霉素的内标，环丙沙星-d₈用作环丙沙星和诺氟沙星的内标，其余同位素标准品用作各自对应标准品的内标。

3. 质量控制：本研究共获得112份样品，包括56份蟹肉和56份蟹内脏。所有样品共分6批次分析完成，每批次分析20份样品。每批样品分析时均新配标准曲线，做2个试剂空白和2个样本加标，加标量为20 μg/kg。 结 果

1. 分析质量评价：在样品分析过程中，加标样品和阳性样品中抗生素和激素的保留时间与标准溶液保留时间偏差均＜0.2%，获得母离子质量数与理论质量数的误差在-3.9～2.9 mDa之间，阳性样本中抗生素二级质谱图与标准质谱图匹配。在2～100 ng/ml浓度范围内，抗生素和激素标准曲线相关系数除雌酮为0.983外，其余均在0.99以上。抗生素蟹肉和内脏中10倍信噪比定量限在0.1～5.0 μg/kg之间，而激素在0.1～0.3 μg/kg之间。由于甲氧苄啶在试剂空白中存在背景干扰，其最终浓度水平扣除该干扰。蟹肉和内脏中抗生素加标回收率在72.8%～127.7%之间，而性激素加标回收率在71.7%～112.7%之间。

2. 抗生素和激素残留水平：蟹内脏和蟹肉中共检出7种抗生素，包括3种喹诺酮类抗生素、3种磺胺类抗生素和甲氧苄啶（表 1）。蟹内脏中抗生素总检出率为32.1%（18/56），质量浓度总和最大值为23.8 μg/kg，第75百分位数浓度为1.5 μg/kg。蟹肉中抗生素总检出率为39.3%（22/56），质量浓度总和最大值为40.5 μg/kg，第75百分位数浓度为1.8 μg/kg。蟹内脏中甲氧苄啶检出率最高（10.7%），其次为磺胺二甲嘧啶（8.9%）。蟹肉中甲氧苄啶和诺氟沙星检出率最高（12.5%），其次为环丙沙星（8.9%）。喹诺酮类抗生素中单个蟹肉样本中残留水平最高的是环丙沙星（40.5 μg/kg），而在蟹内脏中是恩诺沙星（17.2 μg/kg）。磺胺类抗生素中单个螃蟹肉样本中残留水平最高的是磺胺甲恶唑（23.9 μg/kg），而在蟹内脏中是磺胺二甲嘧啶（23.8 μg/kg）。甲氧苄啶在单个蟹内脏或蟹肉样品中的残留水平最高达到2.4 μg/kg。恩诺沙星、诺氟沙星、甲氧苄啶和抗生素质量浓度总和在雌蟹中浓度水平高于雄蟹，但在按内脏和肌肉分层后，这种差别仅存在于内脏之中（表 2）。然而，即使按性别分层，Mann-Whitney秩和检验也未发现7种抗生素浓度分布在蟹内脏和蟹肉之间差异有统计学意义。7种性激素在蟹内脏和蟹肉中均未检出。

表 1 上海市市售中华绒螯蟹抗生素和激素残留水平

表选项

表 2 上海市市售中华绒螯蟹抗生素残留浓度水平的性别分布

表选项

本研究采用同位素稀释超高效液相色谱串联高分辨率四极杆/飞行时间质谱仪分析方法筛查上海市市售中华绒螯蟹中20种常见抗生素和性激素的残留水平。分析质量评价显示该分析方法的定性和定量能力达到欧盟委员会指令2002/657/EC对于生物样品中兽药残留分析方法的有关要求，可以作为蟹肉和内脏中抗生素和性激素残留的分析方法^[10]。而且，与常见基于高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪的分析方法相比，由于超高效液相色谱具有更好的分离效果和高分辨率飞行时间质谱仪可以准确测量化合物分子质量，本研究采用的基于超高效液相色谱串联高分辨率四极杆/飞行时间质谱仪分析方法具有更优异的分离定性能力，可以降低抗生素和性激素检出的假阳性率^[11]。

研究结果显示在蟹中发现的7种抗生素主要是喹诺酮类和磺胺类，其次也包括与磺胺类联合使用的甲氧苄啶，均为农业部2001年饲料药物添加剂使用规范（第168号公告）和2013年兽用处方药品种目录（第1997号公告）规定的可以在动物养殖中使用的药物^{[4, 6]}，但是农业部2002年第235号公告（动物性食品中兽药最高残留限量）仅规定了其中3种抗生素在部分食品中的最大残留限量，未对螃蟹中残留限量做出明确规定^[5]。例如，磺胺二甲嘧啶在牛奶中的最大残留限量为25 μg/kg；甲氧苄啶在鱼肉和鱼皮中最大残留限量为50 μg/kg；恩诺沙星在牛、羊、猪和兔以外动物肌肉和脂肪中最大残留限量为100 μg/kg，而在肝和肾中最大残留限量为200 μg/kg。参照这3种抗生素最大残留量，除蟹肉样本中磺胺甲恶唑最高残留水平（23.9 μg/kg）和蟹内脏中磺胺二甲嘧啶最高残留水平（23.8 μg/kg）接近磺胺二甲嘧啶在牛奶中的最大残留限量外，其余抗生素螃蟹中残留水平明显低于同类别抗生素最大残留限量。此外，蟹中氯霉素和阿奇霉素也未检出，这与它们不用做兽药或在动物中禁止使用的规定一致^{[4, 5, 6]}。

本研究未检出7种激素，其中3种合成性激素（甲基睾酮、去甲雄三烯醇酮和己烯雌酚）是农业部第235号公告中规定的在动物中禁用，而且在食品中为不得检出的条目。然而，已有研究报道在中华绒螯蟹和锯缘青蟹中发现β-雌二醇、雌酮、睾酮和孕酮等性激素，浓度随着它们不同生理周期而变化，参与其生殖过程的正常调控^{[12, 13, 14]}。这与本研究结果不一致，可能与研究之间样品检测部位不同有关。其他研究均采用卵巢或肝胰腺等器官作为分析样品，而本研究将螃蟹内脏全部放在一起混匀分析，可能稀释卵巢或肝胰腺等器官中性激素水平，导致内脏中性激素未检出。

本研究也发现多种抗生素残留水平存在明显性别差异，而且这种差别在蟹内脏中更为显著。这提示蟹抗生素残留水平可能受到雌雄蟹不同生活习性、生理特征或对抗生素不同代谢过程等因素的影响。值得注意的是我国水环境中已报道检出多种抗生素，其中包括在螃蟹中检出的7种抗生素^[15]，提示螃蟹中抗生素残留除来自于喂养过程中人为使用外，抗生素水环境污染也是潜在来源。

本研究为国内首次在上海市市售中华绒螯蟹中同时筛查多种类抗生素和性激素，结果表明上海市市售中华绒螯蟹中抗生素和性激素残留水平满足我国现行规定的相关残留标准，处在健康风险安全范围之内。但考虑到本研究采用方便抽样法收集样本，而且采样点也未覆盖整个上海地区，存在代表性不足的问题，后续研究应当增加样本量验证本研究结果，同时调查抗生素残留来源和影响因素，为降低抗生素残留和人群暴露风险提供依据。