叶酸具有参与和调节DNA甲基化的生物学功 能。研究显示，叶酸缺乏和异常的DNA甲基化与宫 颈癌发生密切相关^{[1, 2]}。本课题组前期研究和国外 多数研究结果均提示，叶酸缺乏与宫颈癌的发生存 在剂量-反应关系^{[3, 4]}，但其机制尚不清楚。脆性组 氨酸三联体（FHIT）基因是一种特殊的抑癌基因，其 异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关，而FHIT基 因CpG 岛甲基化是导致自身功能失活的重要机制 之一^{[5, 6]}。鉴于叶酸在体内作为甲基供体直接参与 DNA甲基化，叶酸缺乏可导致抑癌基因CpG岛高甲 基化，进而推测叶酸可能通过影响FHIT基因甲基化 及蛋白的表达，在宫颈病变中发挥作用，但目前国内 外均未见相关报道。本研究综合分析不同宫颈病变 患者及宫颈癌细胞，探讨叶酸和FHIT蛋白在宫颈癌 及癌前病变中的作用及其相互关系，为宫颈癌病因 和发病机制研究提供科学依据。

1. 研究对象：选取2009 年9 月至2010 年12 月在 山西省肿瘤医院、山西医科大学第二医院、介休市妇 幼保健院经病理学确诊的新发宫颈炎症（CI）患者 80 例、低度宫颈上皮内瘤样变（CINⅠ）患者55 例、 高度宫颈上皮内瘤样变（CINⅡ/Ⅲ）患者55 例以及 宫颈鳞状细胞癌（SCC）患者64 例作为研究对象。 所有研究对象均排除营养性巨幼细胞性贫血、溶血 性疾病、消化道疾病、其他肿瘤患者以及3 个月内B 族维生素使用者，在知情同意下，采用结构式问卷收 集研究对象的人口学特征、宫颈癌相关因素等资料， 同时采集全部研究对象入院后、系统治疗前清晨空 腹静脉血5 ml 和手术或活检宫颈组织标本，常规处 理，置于-80 ℃保存待检。本研究通过山西医科大 学伦理委员会审查。

2. 试验方法：

（1）细胞系选择及培养：选择人乳头瘤病毒16型 （HPV16）阳性宫颈癌细胞CaSki，用含10%小牛血清 的RP MI1640 培养液培养、传代，取对数生长期的CaSki 细胞培养24 h 后，转入含不同浓度叶酸培养液 中培养。以叶酸浓度1 μg/ml 为对照组，以叶酸浓度 10、100、250、500、1 000 μg/ml为5个干预组。各不同 浓度均设3个平行孔，检测不同叶酸浓度下细胞的生 长情况、FHIT基因甲基化状况和蛋白的表达水平。

（2）宫颈组织HPV16 DNA 检测：采用酚-氯仿 法提取宫颈组织总DNA，参照本课题组前期建立 的PCR 扩增方法进行HPV16 DNA 的扩增，确定 HPV16 感染状态^[7]。

（3）血清叶酸含量测定：用1%抗坏血酸溶液处 理血清样本，离心取上清，参照本课题组前期建立的 微生物法检测血清叶酸浓度^[8]。

（4）FHIT基因CpG岛甲基化测定：采用酚-氯仿 抽提法提取宫颈组织和宫颈癌细胞的总DNA，参照 本课题组前期建立的甲基化特异性PCR（MSP）法检 测FHIT 基因CpG岛甲基化状况^[9]。FHIT 基因的甲 基化引物：上游5′-TTG GGG CGC GGG TTT GGG TTT TTA CGC-3′，下游5′-CGT AAA CGA CGC CGA CCC CAC TA-3′；非甲基化引物：上游 5′-TTG GGG TGT GGG TTT GGG TTT TTATG-3′， 下游5′-CATAAACAACAC CAACCC CAC TA-3′， 产物长度均为74 bp。对PCR扩增产物行2%琼脂糖 凝胶电泳，在VILBER CV-A50C 凝胶成像仪下观 察，分别获得FHIT基因甲基化和未甲基化条带。

（5）FHIT蛋白表达的检测：取宫颈组织（50 mg） 或宫颈癌细胞（细胞密度1×10⁶ cell/ml），分别加适 量WIP裂解液和PMSF的混合液，冰浴中匀浆，充分 裂解。10 464 g 离心，取上清后参照本课题组前期 建立的方法（Western blot）检测FHIT 蛋白表达水 平^[3]。一抗为1 ∶ 800 兔抗人FHIT单克隆抗体，在相 对分子质量43×10³和16.8 ×10³处分别获得内参照 蛋白β-actin 和FHIT蛋白条带。利用Quantity One软 件分析条带的A 值，以目的条带与内参β-actin 条带 的A值之比作为FHIT蛋白的相对表达量。

（6）细胞增殖检测：取对数生长期的CaSki 细胞 （细胞密度1×10⁵ cell /ml），接种于含不同浓度叶酸的培养液中培养48 h，0.25%的胰蛋白酶液消化，制 成细胞悬液，显微镜下进行活细胞计数。抑制率＝ （对照组细胞总数－干预组细胞总数）/对照组细胞 总数。

（7）细胞凋亡检测：按上述方法制成细胞悬 液。采用流式细胞术（FCM）收集细胞，离心，弃上 清，PBS 洗涤，过滤，离心，弃上清。PE 染色 （Annexin Ⅴ -PE 凋亡试剂）15 min，加入150 μ l binding buffer，于流式细胞仪检测，获得宫颈癌细胞 的凋亡率。

3. 统计学分析：采用SPSS 17.0 软件进行相关资 料的χ2检验、Kruskal-Wallis（K-W）检验、Spearman 秩 相关分析，计算相关因素与宫颈癌变之间关联强度 的OR 值及其95%CI。应用相加模型及交互作用指 标超额相对危险度（RERI）、交互作用归因比（API） 和交互作用指数（S）进行交互作用定性和定量评 估。检验水准为α＝0.05。

1. 人口学特征及相关因素：CI 组、CINⅠ组、 CINⅡ/Ⅲ组、SCC组的年龄M 值分别为45.0 岁（27～ 57 岁）、46.0 岁（29～67 岁）、44.0 岁（28～64 岁）和 51.0 岁（28～70 岁）。各组间在民族、出生地、居住 地、婚姻状况、肿瘤家族史等方面的差异均无统计学 意义（P＞0.05），但在年龄、文化程度、职业、人工流 产史、妇科病史、HPV16 感染等方面的差异均有统 计学意义（P＜0.05），见表 1。

表 1 研究对象的人口学特征及相关因素分析

注：括号外数据为例数，括号内数据为构成比（%）

表选项

2. 血清叶酸水平与宫颈癌变的关系：血清叶酸 含量为非正态分布，经K-W 检验，各组间血清叶酸 水平的总体分布差异有统计学意义（H＝59.08，P＜ 0.001），其含量随着宫颈病变的加重而降低。以调整 检验水准α＝0.008 3（α＝0.05/比较次数＝0.05/6），采 用Bonferroni 法两两比较发现，SCC 组和CINⅡ/Ⅲ 组的血清叶酸含量低于CINⅠ组和CI 组，差异均有 统计学意义，但SCC 组与CINⅡ/Ⅲ组、CIN Ⅰ组与 CI 组间的差异均无统计学意义。进一步以CI 组血 清叶酸含量的50%点值为界，≤5.96 ng/ml 为低叶酸 水平进行分析，结果显示，低血清叶酸率在SCC组、 CINⅡ/Ⅲ组和CINⅠ组均高于CI 组，随宫颈病变程 度的加重低血清叶酸率逐渐升高（趋势χ²＝32.71， P＜0.001），见表 2。

表 2 血清叶酸含量、FHIT基因甲基化和FHIT蛋白表达与宫颈癌变的关系

注：同表 1；M±Q 为中位数±四分位数间距；a，b组间比较时相同字母表示差异无统计学意义（P＞0.05），不同字母表示差异有统计学意义 （P＜0.05）

表选项

3. FHIT 基因甲基化和蛋白表达与宫颈癌变的 关系：FHIT基因的甲基化率随着宫颈病变的加重逐 渐升高（趋势χ²＝28.34，P＜0.001）。FHIT 蛋白表达量为非正态分布，经K-W检验，各组间FHIT 蛋白表 达量总体分布差异有统计学意义（H＝50.93，P＜ 0.001），其含量随着宫颈病变的加重而降低。调整检 验水准，采用Bonferroni 法两两比较发现，SCC 组、 CINⅡ/Ⅲ组和CINⅠ组的FHIT 蛋白表达量均低于 CI 组，差异均有统计学意义，但三组间相互的差异 均无统计学意义。进一步以CI 组FHIT 蛋白表达量 的50%点值为界，≤1.26 为低蛋白表达进行分析，结果显示，FHIT 蛋白低表达率在SCC 组、CINⅡ/Ⅲ组 和CINⅠ组均高于CI 组，随宫颈病变程度的加重 FHIT 蛋白低表达率逐渐升高（趋势χ²＝44.96，P＜ 0.001），见表 2。

4. 血清叶酸与FHIT 蛋白表达在宫颈癌变中的 相互关系：采用Spearman 秩相关分析显示，宫颈病 变患者总体血清叶酸含量与FHIT 蛋白表达量呈正 相关（r＝0.213，P＝0.001），见图 1。进一步以CI 组 血清叶酸含量的50%点值（5.96 ng/ml）和FHIT 蛋白 表达量的50%点值（1.26）分别作为低血清叶酸水平 和FHIT蛋白低表达的界值，应用相加作用模型进行 交互效应分析。结果显示，叶酸缺乏和FHIT蛋白低 表达在CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和SCC 组均呈现正相 加交互作用，交互作用指标RERI、API和S均显示正 相加效应，调整宫颈癌相关因素后这种交互作用模 式仍然存在，各组间调整OR（aOR）值均有统计学意 义（表 3）。

图 1不同宫颈病变组血清叶酸含量与FHIT蛋白 表达量的关系

图选项

表 3血清叶酸与FHIT蛋白在各宫颈病变组中的交互作用

注：调整年龄、文化程度、职业、人工流产史、妇科病史、HPV16 感染等因素

表选项

5. 叶酸干预对宫颈癌细胞增殖凋亡及FHIT 基 因表达的影响：随着叶酸浓度的增加，宫颈癌细胞的 增殖抑制率（r＝0.98，P＜0.001）和凋亡率（r＝0.99， P＜0.001）均逐渐上升，与叶酸水平呈正相关；FHIT 基因甲基化程度逐渐减弱；FHIT蛋白表达水平均逐渐增高，与叶酸水平呈正相关（r＝0.97，P＜0.001）， 见表 4。

表 4 不同叶酸水平对宫颈癌细胞生长和FHIT蛋白表达量的影响

表选项

宫颈癌是女性第二大恶性肿瘤，全球新发病例 80%以上来自发展中国家^[10]。目前已证实HPV 感 染，特别是高危型HPV（HR-HPV）感染是宫颈癌发 生的主要病因^[11]。HPV与宿主细胞DNA整合是致 癌过程的必要环节，该整合最易发生在染色体脆性 位点FRA3B处，而叶酸缺乏可导致这种整合的概率 增加^[12]，提示叶酸缺乏可能导致HPV的持续性感染 进而增加宫颈癌的发生风险。研究表明，高血清叶酸水平的妇女感染HR-HPV 的风险较低，补充叶酸 对宫颈癌前病变有逆转作用^[13]。本课题组前期对叶 酸与宫颈癌关系的Meta 分析显示随着叶酸水平降 低，患宫颈癌的危险性增加^[14]。本次研究显示随着 宫颈病变的加重，血清叶酸含量呈现逐渐降低的趋 势，且SCC 组和CINⅡ/Ⅲ组的叶酸水平明显低于 CINⅠ组和CI 组，再次验证了叶酸缺乏可增加宫颈 癌发生风险的结论。在此基础上，本次进一步采用 叶酸干预的体外实验研究，结果显示随着叶酸浓度 的增加，宫颈癌细胞的增殖抑制率和凋亡率均逐渐 上升，且均与叶酸浓度呈正相关。说明叶酸可以有 效抑制宫颈癌细胞生长，提示在人群中适当补充 叶酸对宫颈癌及癌前病变的预防和控制具有重要 意义。

近年研究显示，HPV感染的妇女发展为宫颈癌 者仅占较小比例，提示单纯HPV感染不足以引起宫 颈癌的发生，很可能存在其他致癌因子或HPV协同 因子。研究表明，宫颈癌的发生发展与多个抑癌基 因的失活有关，FHIT 基因定位于染色体3p14.2，覆 盖了染色体脆性位点FRA3B 及HPV16 DNA 整合 点，FHIT 基因异常与HPV 可协同触发宫颈癌发生 与进展^[15]。研究发现，随着宫颈病变程度的加重， FHIT蛋白表达水平逐渐下降^{[5, 16]}。本次研究分别采 用甲基化特异性PCR 和Western blot 法测定组织和 细胞中FHIT 基因甲基化状态和蛋白表达水平。结 果显示，随着宫颈病变的进展，FHIT 基因的甲基化 率逐渐升高，FHIT 蛋白的表达水平逐渐降低，且 SCC组和CIN 组明显低于CI 组。提示FHIT 基因高 甲基化和FHIT 蛋白低表达均与宫颈癌及癌前病变 的发生密切相关，特别发现FHIT蛋白这一代表基因 功能状态的指标，在宫颈癌前病变的早期阶段即发 生了下调，提示FHIT蛋白的检测对宫颈癌变的早期 发现具有重要的预警意义。

研究显示，宫颈组织中FHIT基因的异常甲基化是FHIT 蛋白失活的重要机制之一^{[6, 17, 18]}。而叶酸作 为甲基供体参与DNA 的甲基化过程，叶酸缺乏可 导致抑癌基因异常甲基化，提示叶酸可能通过影响 FHIT 基因的甲基化状态，进而对FHIT 蛋白的表达 产生影响，但目前尚未见相关报道。本次研究显 示，随着宫颈病变的加重，血清叶酸含量和FHIT 蛋 白表达量均呈降低趋势，两者间存在正相关关系； 在CINⅠ 组、CINⅡ/Ⅲ 组和SCC 组，叶酸缺乏和 FHIT蛋白低水平表达均存在正相加交互作用，且该 交互作用随着宫颈病变的加重逐渐增大。体外研究 发现，随着叶酸干预浓度的增加，FHIT 基因的甲基 化程度逐渐减弱，FHIT 蛋白的表达水平逐渐升高， 验证了宫颈病变妇女中的研究结果，同时提示，补充 叶酸可能逆转FHIT 基因的高甲基化和蛋白低表 达。本次研究从患病群体和体外干预实验研究两个 层面，均揭示叶酸缺乏和FHIT基因的功能降低或缺 失在宫颈病变的恶性演进中均具有重要作用，当两 者同时存在时，其作用具有正相加交互效应，同时提 出叶酸缺乏可能通过引起FHIT 基因高甲基化和蛋 白低表达进而在宫颈病变中起重要作用的分子机 制，为后续进行宫颈癌及其癌前病变病因和机制的 研究提供了新线索，为该病干预和治疗的策略和方 案的制定开拓了新思路。