中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (4): 379-382   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.04.018
中华医学会主办。
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彭瑾瑜, 陈曦, 贺健梅, 郑军, 覃碧云, 江洋. 2014.
Peng Jinyu, Chen Xi, He Jianmei, Zheng Jun, Qin Biyun, Jiang Yang. 2014.
白细胞介素-28B和平衡性核苷转运载体1基因多态性与HIV/HCV合并感染者HCV自发清除的关系研究
Relationship between interleukin 28B, equilibrative nucleoside transporters 1 gene polymorphisms and spontaneous clearance of HCV in HIV/HCV co-infectors
中华流行病学杂志, 2015, 36(4): 379-382
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(4): 379-382
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.04.018

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投稿日期:2014-10-09
白细胞介素-28B和平衡性核苷转运载体1基因多态性与HIV/HCV合并感染者HCV自发清除的关系研究
彭瑾瑜, 陈曦 , 贺健梅, 郑军, 覃碧云, 江洋    
410005 长沙, 湖南省疾病预防控制中心
摘要目的 分析湖南省HIV/HCV合并感染者的白细胞介素-28B(IL-28B)和平衡性核苷转运载体1(ENT1)基因多态性与HCV自发清除的关系。方法 对湖南省107例HIV/HCV合并感染者的IL-28B和ENT1基因位点(rs12980275、rs12979860、rs8099917和rs760370)进行分型, 比较其在慢性肝炎组和自发清除组的基因多态性分布。结果 在HIV/HCV合并感染者中, IL-28B基因rs12980275、rs12979860和rs8099917位点的主要基因型分别为AA、CC和TT型, 均占84.1%。3个位点高度连锁不平衡(r2>0.94), 慢性肝炎组和自发清除组基因型分布差异有统计学意义(P<0.05), 携带IL-28B主要基因型的感染者更易发生HCV自发清除。ENT1基因的rs760370位点基因型分布在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-28B基因AA、CC和TT型与HCV自发清除有关。
关键词丙型肝炎病毒     人类免疫缺陷病毒     白细胞介素-28B     平衡性核苷转运载体1     自发清除     单核苷酸多态性    
Relationship between interleukin 28B, equilibrative nucleoside transporters 1 gene polymorphisms and spontaneous clearance of HCV in HIV/HCV co-infectors
Peng Jinyu, Chen Xi , He Jianmei, Zheng Jun, Qin Biyun, Jiang Yang    
Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Changsha 410005, China
Abstract: Objective To explore the association between interleukin 28B(IL-28B), equilibrative nucleoside transporters 1(ENT1) gene polymorphisms and spontaneous clearance of HCV in HIV/HCV co-infectors in Hunan province. Methods Genotypes of IL-28B and ENT1 (rs12980275, rs12979860, rs8099917 and rs760370) were analyzed in 107 HIV/HCV co-infectors in Hunan province and the distributions of gene polymorphisms were compared between chronic hepatitis and spontaneous clearance groups. Methods The major genotypes in rs12980275, rs12979860 and rs8099917 of IL-28B were AA, CC and TT in HIV/HCV co-infectors, which accounted for 84.1% of each. The three single nucleotide polymorphisms were highly linkage disequilibrium(r2>0.94)and the differences of genotype distribution were statistically significant between chronic hepatitis and the spontaneous clearance groups(P<0.05). Infectors which carrying the major genotypes were more susceptible to spontaneous clearance of HCV. Differences of the genotype distributions in rs760370 of ENT1 were not statistically significant between the two groups. Conclusion Genotypes AA, CC and TT of IL-28B were related to spontaneous clearance of HCV in HIV/HCV co-infectors.
Key words: Hepatitis C virus     Human immunodeficiency virus     Interleukin 28B     Equilibrative nucleoside transporters 1     Spontaneous clearance     Single nucleotide polymorphism    

研究显示,白细胞介素-28B(IL-28B)基因的一研究显示,白细胞介素-28B(IL-28B)基因的一些单核苷酸多态性(SNP)位点与HCV 感染者的 HCV自发清除、慢性感染和治疗效果密切关联[1, 2, 3]。 细胞膜上的一种载体蛋白-平衡性核苷转运载体1 (equilibrative nucleoside transporters 1,ENT1)对利 巴韦林在肝细胞中的转运和摄入起重要作用,ENT1基因多态性可能影响抗HCV治疗效果[4]

HIV/HCV 合并感染已成为艾滋病患者死亡的 主要原因之一[5]。本研究对湖南省HIV/HCV 合并 感染者IL-28B和ENT1 基因多态性进行研究。

对象与方法

1. 研究对象:湖南省HIV-1/HCV 合并感染者, 共107 例。将研究对象分为两组:①慢性丙肝组:诊 断标准符合卫生部颁布的《丙型病毒性肝炎诊断标 准》(WS 213-2008),HCV 抗体阳性超过6 个月, HCV-RNA 仍为阳性。②自发清除组:HCV抗体阳 性,而HCV-RNA阴性,没有慢性丙肝病史。两组均 未接受干扰素联合利巴韦林抗病毒及抗反转录病毒 治疗。同时收集两组人群人口学、感染途径、肝功 能、CD4T淋巴细胞资料。

2. 实验室检测:收集两组研究对象EDTA抗凝 血,检测CD4T 淋巴细胞后分离血浆和淋巴细胞富 集液,-70 ℃保存待检。

(1)HCV抗体检测:用酶联免疫吸附试验检测, 试剂为珠海丽珠试剂股份有限公司的HCV抗体诊 断试剂盒。

(2)HCV核酸定量和基因分型:采用实时荧光 定量PCR 方法检测,检测下限为15 IU/ml。试剂由 上海复星长征医学科学有限公司提供,仪器为美国 ABI公司的7500Fast荧光定量PCR仪。

(3)IL-28B和ENT1 基因多态性分析:采用德国 Qiagen 公司的全血DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA,利用多重PCR 扩增目的基因、多重连接酶检 测反应连接基因片段,测序,然后对IL-28B基因的3 个SNPs 位点(rs12980275、rs12979860 和rs8099917) 和ENT1 基因的1 个SNP 位点(rs760370)进行分 型。引物rs12980275(FP:5′-CTA TTA ACC CCT CCC GCT AC-3′和RP:5′-ATG AGG TGC TGA GAG AAG TC-3′);rs12979860(FP:5′- TCG TGC CTG TCG TGT ACT GA-3′和RP:5′-AGC GCG GAG TGC AAT TCAAC-3′);rs8099917(FP:5′-CAA TTT GTC ACT GTT CCT CC-3′和RP:5′-ACT GTA TAC AGC ATG GTT CC-3′);rs760370(FP: 5′- TTG AGG GAA CGT GTA TGG TG -3′和RP: 5′- CCA AGC TTA CTT GGG TGG AG -3′)。PCR 反应条件:95 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 1 min, 65 ℃ 30 s,35 个循环;65 ℃ 10 min。

(4)CD4T 淋巴细胞计数:采用美国BD公司生 产的FACSCalibur流式细胞仪和相关试剂。

3. 统计学分析:用SPSS 19.0 软件处理数据,计 量资料用x±s 表示,采用t 检验;计数资料用χ2检验, 以P<0.05 为差异具有统计学意义,理论频数<5 时 使用Fisher 精确检验。对样本人群中IL-28B 和 ENT1 基因的SNPs进行H-W遗传平衡分析使用χ2检 验。SNPs 间的连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)用Haploview 4.2软件分析[6]

结果

1. 一般特征:107 例HIV/HCV合并感染者中,男 性83 例,女性24 例,年龄为(36.84±7.2)岁,平均 CD4T淋巴细胞数为(282.0±196.7)cells/μl,主要为 静脉吸毒途径感染(83 例,占77.5%)。其中慢性肝 炎组80 例,自发清除组27 例,两组年龄、性别、 CD4T淋巴细胞数和感染途径差异无统计学意义, 肝功能指标ALT和AST差异有统计学意义,总胆红 素(Total Bilirubin,TB)和血小板(Platelet,PLT)差异 无统计学意义。慢性肝炎组的平均HCV-RNA (log10)含量为5.90 IU/ml,其中18 例为HCV 基因1 型感染,见表 1

表 1 107 例HIV/HCV合并感染者的一般特征
注:a 由于例数太少,将静脉吸毒与其他3 种途径合并进行2×2 的χ2检验;括号外数据为人数,括号内数据为构成比(%)

2. IL-28B和ENT1 基因SNPs 位点H-W遗传平 衡分析:107 例HIV/HCV 合并感染者中,rs12980275 位点AA型90 例(84.1%),AG型15 例(14.0%),GG 型2 例(1.9% );rs12979860 位点CC 型90 例 (84.1%),CT 型16 例(15.0%),TT 型1 例(0.9%);rs8099917 位点TT 型90 例(84.1%),TG 型16 例 (15.0%),GG型1 例(0.9%);rs760370 位点AA型60 例(56.1%),AG 型39 例(36.4%),GG 型8 例 (7.5%)。H-W遗传平衡检验显示,慢性肝炎组和自 发清除组均P>0.05,4 个基因型频率符合遗传平衡 法则,分布均匀,具有群体代表性。

3. IL-28B和ENT1 基因的SNPs 与HCV自发清 除的相关性分析:对慢性肝炎组和自发清除组 IL-28B 基因的3 个SNPs 位点rs12980275、 rs12979860 及rs8099917 的基因型和3 者的单体型 (AA,CC,TT)进行比较,均P<0.05,差异有统计学 意义,在自发清除组中rs12980275 位点的AA 基因 型、rs12979860 位点的CC基因型、rs8099917 位点的 TT 基因型以及3 者的单体型(AA,CC,TT)频率均 为100%,高于慢性肝炎组,差异有统计学意义。而 rs760370 的基因型在两组间差异无统计学意义,P> 0.05,见表 2

表 2 IL-28B和ENT1 基因的4 个SNPs位点与HCV自发清除的关系
注:a 由于例数太少,将AA,CC,TT组与其他3 组合并进行2×2 的r2检验;其余同表1

4. IL-28B 和ENT1 基因4 个SNPs 的LD 分析: 在IL-28B 基因3 个位点rs12980275、rs12979860 和 rs8099917 的基因型分别以AA、CC 和TT 为主, rs12980275 和rs12979860、rs12980275 和rs8099917 的r2=0.94,rs12979860 和rs8099917 的r2=1.00,3 个 位点间存在高度LD。ENT1 基因的rs760370 位点与 这3个位点的r2远小于0.50,LD程度低,见图 1

注:方格中数字代表r2值,其中空方格r2=1.00 图 1 IL-28B和ENT1 基因4 个SNPs位点的LD分析
讨论

本研究显示,湖南省HIV/HCV合并感染人群的 IL-28B的rs12980275、rs12979860 和rs8099917 主要基因型分别为AA、CC和TT型,均占84.1%,次要基 因型分别为AG/GG、CT/TT 和TG/GG。在HCV 自 发清除组,3 个SNPs 位点均为主要基因型,未发现 其他基因型。而在慢性肝炎组,主要基因型频率 均<80%,提示IL-28B的rs12980275、rs12979860 和 rs8099917 主要基因型(AA、CC 和TT 型)可能与 HCV自发清除相关。本研究还显示,IL-28B基因的 3 个SNPs 存在着高度LD(r2>0.94),提示可选择某 个位点作为标签SNP预测HCV感染后的转归。

国内外关于中国人群的IL-28B基因型分布与 本研究稍有所不同[1, 7, 8, 9]。Thomas 等[1]发现在华裔人 群中rs12979860 的CC 基因型约占93.6%~97.5%, 而非洲裔人群只占23.1%~54.8%。而Rao 等[8]发现 在中国河北省有偿献血人群中rs12980275 的AA基 因型和rs8099917 的TT 基因型分别占86.0% 和 86.7%,与本研究基本一致,但是rs12979860 的CC 基因型只占48.5%,远低于本研究数据,可能与研究 人群来源、地区和种族等因素有关。Rao等[8]的研究 显示,rs12980275、rs12979860 和rs8099917 呈现高度 LD,与本研究一致。国外对HCV感染人群进行全 基因组关联分析,研究发现宿主基因IL-28B变异在 HCV 感染后的自发清除方面起到关键作用[1, 10, 11, 12]。 Rauch 等[11]对347 例HCV 自发清除者和1 015 例慢 性HCV 感染患者研究显示,在IL-28B 附近有7 个 SNPs 位点与HCV自发清除相关,最有意义的能强 烈预测HCV自发清除的位点是rs8099917。IL-28B 编码的干扰素-λ3 主要功能包括抗病毒、抗细胞增 值和调节适应性免疫应答,而IL-28B基因编码区上 游的位点rs12980275、rs12979860 和rs8099917 的主 要基因型携带者有较高的HCV自发清除率,一般认 为在DNA的启动子或增强子附近位点对基因转录 有很大影响,推测这3 个SNPs 可能影响了IL-28B基因的表达水平,从而影响宿主干扰素-λ的合成有 关。但是本研究也发现,即使在IL-28B基因的3 个 SNPs 的主要基因型中,也只有30.0%(27/90)的携带 者发生了HCV自发清除,所以不能只依靠基因多态 性进行HCV感染后转归预测,应结合病毒基因型、 病毒载量、种族、临床症状等进行综合评判。

Morello 等[4]发现ENT1 基因rs760370 位点的 GG基因型更容易获得抗HCV治疗的快速应答。但 在本研究中,rs760370 的基因型分布在慢性肝炎组 和自发清除组中的差异无统计学意义,提示其与 HCV自发清除无关。

对于HIV/HCV 合并感染者来说,首先进行抗 HIV 治疗还是抗HCV治疗一直存在争议。在HCV 单独感染者有20%~30%会发生自发清除[13],本研 究中也有25.2%(27/107)的HIV/HCV合并感染者发 生了HCV自发清除,提示即使感染了HIV,HCV感 染仍有一定比例自愈,所以应进一步开展研究,比较 HIV/HCV合并感染者和HCV单独感染者的HCV自 发清除率及影响因素。本研究显示,IL-28B基因多 态性对HCV自发清除具有很强的预测价值,建议针 对携带IL-28B次要基因型的HIV/HCV合并感染者 立即开展抗HCV 治疗,因为该人群不太可能发生 HCV自发清除,而对携带主要基因型的感染者可以 根据临床症状和CD4T淋巴细胞数首先开展抗反转 录病毒治疗,确定HCV 无法自发清除后再进行抗 HCV治疗。

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