结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌。据 WHO统计^[1],我国结核病患病人数及耐药菌感染 人数均居全球第二,而我国西南地区结核病疫情较 严重,其中四川盆地(重庆、四川地区)由于其独特 的人文地理位置,结核病疫情对整个地区的影响不 容忽视。前期Li 等^[2]采用Spoligotyping 分型技术 将四川地区292 株MTB 分为北京谱系(54.8%)和 非北京谱系(45.2%)两个大群。但有关该地区 MTB群体遗传结构以及群体间遗传分化的研究未 见报道。为此本研究采用长序列多态性(large sequence polymorphism,LSP)和15 位点数目可变串 联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR) 两种基因分型技术,对收集自四川盆地的413 株 MTB 进行群体遗传学特征分析,探讨该地区MTB 的流行特征。 材料与方法

1. 实验菌株：432 株MTB取自2007－2008 年全 国结核病耐药基线调查中重庆市和四川省分离株 ^[3],由国家结核病临床实验室提供。其中重庆市包 括丰都县(采样点收集60 株/本研究纳入60 株,60/ 60)、奉节县(67/67)2 个采样点；四川省包括峨眉山 市(60/54)、通江县(62/62)、武胜县(65/61)、江油市 (58/53)、涪城区(60/56)5 个采样点。因19 株MTB 复苏未成功而舍弃,最终413 株(95.6%)MTB 纳入 研究。

2. 试剂和仪器：2 × Taq Master Mix、100 bp Ladder 以及RD105 鉴定北京谱系MTB试剂盒均购 自北京康为世纪生物科技有限公司；Bio Numerics 5.0分析软件购自比利时Applied Maths公司。

3. LSP 鉴定谱系：参照文献^{[4, 5]}选定RD105、 RD239、RD702、RD711、RD750 以及pks15/1Δ7 bp 共 6 个DNA 片段作为MTB 谱系定义靶标,针对每一 RD 片段分别进行PCR 扩增,以检测相应片段有无 缺失鉴定MTB谱系。其中北京谱系MTB的鉴定采 用RD105 商品化试剂盒；对经鉴定的北京谱系MTB 进一步行RD181 为靶标的“古老”或“现代”亚谱系 分型^[6]。pks15/1Δ7 bp 引物设计参照文献^[5],扩增 该目的基因可分别获得398 bp(缺失7 个碱基)和 405 bp(完整)两种片段长度的扩增产物,欧美谱系 特异性缺失5′-GCCGCGG-3′7 个碱基。通过基因 测序比对完成欧美谱系MTB的鉴定。一株菌对应 一名病例,采用X²检验分析该地区不同谱系MTB在 人群性别、年龄、民族以及耐药情况上的差异是否具 有统计学意义(P<0.05)。

4. VNTR基因分型：采用标准15 位点VNTR基 因分型(VNTR-15)方法^[7]。计算VNTR-15 对不同 谱系MTB的总体分辨力以及各VNTR位点的分辨 力(汉高分辨指数Hunter-Gaston Discriminatory Index,HGI)^[8]。

5. 群体遗传学分析：将413 株MTB 的LSP 和 VNTR数据一并上传至MIRU-VNTR数据库(http：// www.miru-vntrplus.org)与代表菌株进行比对分析。 结合VNTR-15 数据,以M. prototuberculosis(包含 M. canettii)为外群构建N-J 进化树；采用Bio Numerics 5.0 软件构建最小跨度树(minimun spanning tree,MST)。本研究将该地区不同谱系 MTB 分别设定为一个群体,采用Arlequin 3.5 软件 通过分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)计算成对群体间遗传分化系数(F_ST)^[9],推 测对应群体之间是否存在显著的遗传分化。

6. 欧美谱系MTB 最近共祖年代的计算：前期 Comas 等^[10]对全球范围内主要谱系MTB的起源进 化以及共祖年代进行较细致的研究,推测北京谱系 MTB起源于东亚地区,欧美谱系MTB起源于欧洲 大陆。Pepperell 等^[11]推导了DS6QUE 欧美亚谱系 MTB通过法国人皮毛贸易由加拿大东海岸登陆并 跟随贸易活动向西海岸传播的过程。参照Pepperell 方法,采用贝叶斯模型,突变速率为10^-3每 位点每代,增长速率为10³每代,利用Ytime 软件计 算该群欧美谱系MTB的最近共祖年代(time of the most recent common ancestor,TMRCA)。 结果

1. LSP鉴定谱系：北京谱系占收集菌株的56.2% (232/413),欧美谱系占43.8%(181/413),未发现其 他谱系MTB。两谱系MTB 与MIRU-VNTR 数据 库中的北京谱系和欧美谱系MTB 代表菌株汇聚 良好。北京谱系MTB 中“现代”亚谱系所占比例 为90.9%(211/232),“古老”亚谱系仅占9.1%(21/ 232)。结合国内现有研究数据,设计适合我国MTB 的LSP谱系鉴定流程图(图 1)。经χ2检验验证,该地 区两谱系MTB在人群性别、年龄、民族分布以及耐 药上的差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。

图 1 LSP谱系鉴定流程

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表 1 3个亚组各参数的估计结果

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2. VNTR-15 基因分型的分辨力：VNTR-15 将 232 株北京谱系MTB和181 株欧美谱系MTB分为 210 和175 个基因型,HGI 分别为0.998 6 和0.999 6。 QUB11b、QUB26、Mtub21、MIRU26 位点对该地区 北京谱系和欧美谱系MTB 均具有较高的分辨力 (HGI＞0.5)；MIRU04、MIRU40、MIRU16、ETR-A、 Mtub39 位点对该地区欧美谱系的分辨力均高于北 京谱系MTB(表 2)。

表 2 四川盆地不同谱系MTB中VNTR-15各位点的HGI比较

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3. 系统发育分析：232 株北京谱系MTB 的N-J 树呈“放射状”分布(图 2),提示这些菌株可能由 某一“克隆”进化而来；MST中有72.4%(168/232)的 菌株被划分到同一“克隆复合群”(图 3),表明该 群北京谱系MTB的克隆扩展能力较强。欧美谱系 MTB的N-J 树呈“枝状”分布(图 2),提示这 些菌株可能是“多克隆”起源；MST显示有多 个较明显的“克隆复合群”,其中最大的克隆 复合群包含39.2%(71/181)的菌株(图 3)。

图 2 232株北京谱系MTB（）和181株欧美谱系MTB（）基于VNTR-15的系统发育N-J树

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图 3 232株北京谱系MTB（）和181 株欧美谱系MTB（）基于VNTR-15 的MST

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4. 群体菌株间的分子方差分析：就北京 谱系MTB而言,重庆、四川两群菌株群体间 遗传分化较显著(F_ST＝0.018 91,P<0.05)； 就欧美谱系MTB而言,重庆、四川两群菌株 群体间遗传分化不显著(F_ST＝0.005 19,P> 0.05)。以全部菌株为总体,计算北京谱系与 欧美谱系MTB 之间的FST,得到显著的P 值 (F_ST＝0.304 09,P＝0.000),两谱系MTB群体 间遗传分化显著。

5. 针对欧美谱系MTB的TMRCA计算：选定欧 美谱系MTB中最大的菌株复合群(共71株,处于N-J 树同一进化分支,在MST中属于同一克隆复合群)进 行共祖年代计算,得到TMRCA为723(95%CI：517～ 946)年。 讨论

LSP 是基于MTB 基因组中分化区(region of difference,RD)的缺失而建立的谱系鉴定技术,通过 该技术可将全球的MTB分为6 大谱系,即环印度洋 系、北京谱系、欧美谱系、东非-印度系、西非-1 系、 西非-2 系,且每个谱系MTB均与对应的地理人群存 在着一定联系^{[5, 12]}。本研究采用LSP 对四川盆地的 413 株MTB 进行谱系鉴定,得到北京(56.2%)和欧 美(43.8%)两个谱系。结合我国MTB的总体流行情 况,北京谱系MTB是我国主流流行菌(流行比例约 为62.2%,南北地区略有不同^[13]),欧美谱系MTB在 我国亦有一定程度的流行,而西非谱系MTB几乎未 在我国发现^[12],因此设计了适合我国MTB谱系鉴定 的LSP流程图。该地区北京谱系与欧美谱系MTB在 人群年龄、性别、民族分布以及耐药性上的差异无统 计学意义,提示欧美谱系MTB与当地宿主人群的联 系和北京谱系MTB基本一致。本研究表明,在四川 盆地欧美谱系与北京谱系MTB呈“相互对抗”式的流 行,与东、中部地区北京谱系MTB高水平的流行特征 不同^{[14, 15]}；欧美谱系MTB和该地区宿主人群的联系 与Gagneux 等“其与欧美人群存在稳定联系^[12]”的结 论不同。因此有必要以群体遗传学为切入点,探讨导 致该地区较为特殊的MTB流行现状的原因。

本研究中VNTR-15 对该地区两谱系MTB的总 体分辨力均较高。北京谱系MTB在该地区呈现出 较强的克隆扩展状态；而欧美谱系MTB则趋向于多 克隆、多中心起源状态。前期研究表明北京谱系 MTB无论是在东亚还是在美洲大陆等地区其菌株 群均呈克隆状态扩展^{[14, 16]}；欧美谱系MTB则由于谱 系内亚型较多以及欧美国家人口密度较小等因素导致其多呈枝状扩展^[17]；可见该地区流行的北京谱系和 欧美谱系MTB的群体遗传结构并未发生明显改变。

本研究将四川盆地分成重庆、四川两个地区进 行分析,以期能够发现该地区北京谱系和欧美谱系 MTB的群体间遗传分化是否存在差异。分子方差 分析显示,北京谱系MTB在重庆、四川两地区间存 在较显著的群体间遗传分化,而欧美谱系MTB的群 体间遗传分化不显著。前期研究表明,北京谱系 MTB起源于东亚,早在新石器时代(约8 000 年前) 就已在我国出现,且随着现代人的不断繁衍迁移在 东亚大范围扩展^[10]；北京谱系MTB在接下来的历史 长河中可能先后遇到了不同的自然选择压力和不同 的群体内遗传漂变以及有限范围内的基因漂流等多 重因素,从而导致不同地区菌株间出现了较显著的 遗传分化。欧美谱系MTB起源于欧洲大陆,且遗传 多样性较大^[10],这一特点使其作为外来物种能够更 好地适应新的环境,可能是其成功入侵定植的原因 之一；欧美谱系MTB作为入侵物种可能在随后较短 的时间内遇到了较为一致的自然选择压力以及来自 当地北京谱系MTB的“挤压”,从而导致不同地区菌 株间遗传分化不显著。分析该地区欧美谱系MTB 主要菌株复合群的最近共祖年代为720 年,结合该 地区特殊的地理历史(重庆市合川区钓鱼城)^[18],本 研究据此推测：700 多年前的合川钓鱼城战争,即公 元1260 年(宋末元初)蒙古铁骑从征战中的欧洲大 陆收兵,全力攻打巴蜀咽喉合川钓鱼城,战争持续 36 年之久,而蒙古骑兵很可能也将欧洲大陆较为流 行的欧美谱系MTB带到该地区,并此后随人类活动 传播扩展。

我国由于北京谱系MTB流行程度高,因此忽视 了流行程度较低但在欧美国家呈高水平流行的欧美 谱系MTB的研究。本研究以四川盆地北京谱系和 欧美谱系MTB呈“对抗”式流行现象为切入点,设计 了适合我国MTB的LSP谱系鉴定流程图,并发现该 地区北京谱系与欧美谱系MTB在群体遗传结构以 及群体间遗传分化上存在差异；计算最近共祖年代 推测出欧美谱系MTB可能的入侵年代。此结果有 助于探讨北京谱系、欧美谱系乃至整个MTB复合群 的生物进化机制,为当地乃至全国结核病防治提供 科学依据。