中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (4): 368-373   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.04.016
中华医学会主办。
0

文章信息

郑雅匀, 曹玉玺, 付士红, 程璟侠, 赵俊英, 代培芳, 孔祥盛, 梁国栋. 2014.
Zheng Yayun, Cao Yuxi, Fu Shihong, Cheng Jingxia, Zhao Junying, Dai Peifang, Kong Xiangsheng, Liang Guodong. 2014.
山西省运城市2012年蚊媒病毒的分离鉴定
Isolation and identification of mosquito-borne arboviruses in Yuncheng city, Shanxi province, 2012
中华流行病学杂志, 2015, 36(4): 368-373
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(4): 368-373
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.04.016

文章历史

投稿日期：2014-10-29
引用本文
郑雅匀, 曹玉玺, 付士红, 程璟侠, 赵俊英, 代培芳, 孔祥盛, 梁国栋. 2015. 山西省运城市2012年蚊媒病毒的分离鉴定[J]. 中华流行病学杂志, 36(4): 368-373
Zheng Yayun, Cao Yuxi, Fu Shihong, Cheng Jingxia, Zhao Junying, Dai Peifang, Kong Xiangsheng, Liang Guodong. 2015. Isolation and identification of mosquito-borne arboviruses in Yuncheng city, Shanxi province, 2012[J]. Chinese Journal of Epidemiology, 36(4): 368-373.
山西省运城市2012年蚊媒病毒的分离鉴定
郑雅匀1, 曹玉玺1, 付士红1, 程璟侠2, 赵俊英2, 代培芳2, 孔祥盛2, 梁国栋1     
1. 100052 北京, 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室;
2. 山西省疾病预防控制中心
收稿日期:2014-10-29
基金项目：国家自然科学基金(81290342); 国家重点基础研究发展计划(973计划)(2011CB504702)
通信作者: 梁国栋,Email:gdliang@hotmail.com;
摘要：目的 了解山西省运城市蚊虫及蚊媒病毒的种类和分布。方法 2012年8月在山西省运城市临猗县和永济市采集蚊虫标本, 经鉴定分类和分批研磨后, 利用细胞(C6/36和BHK21)培养方法分离病毒, 对阳性分离物使用蚊媒病毒种属特异引物进行RT-PCR扩增鉴定。结果 采集4属7种10 455只蚊虫, 临猗县和永济市优势蚊种分别为淡色库蚊(91.96%)和三带喙库蚊(72.85%)。经鉴定分析, 从标本中分离到15株基因Ⅰ型乙型脑炎病毒(JEV)、4株库蚊黄病毒(CxFV)、3株淡色库蚊浓核病毒(CppDNV)和1株盖塔病毒(GETV)。结论 首次从山西省分离GETV和CxFV;三带喙库蚊仍是运城市优势蚊种, 目前当地自然循环的JEV仍以基因Ⅰ型为主。
关键词： 蚊媒病毒     乙型脑炎病毒     盖塔病毒     库蚊黄病毒    
Isolation and identification of mosquito-borne arboviruses in Yuncheng city, Shanxi province, 2012
Zheng Yayun1, Cao Yuxi1, Fu Shihong1, Cheng Jingxia2, Zhao Junying2, Dai Peifang2, Kong Xiangsheng2, Liang Guodong1     
1. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China;
2. Shanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention
Abstract: Objective To investigate the species and distribution of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Yuncheng city of Shanxi province, China. Methods Mosquito samples were collected in 19 collection sites from Linyi county and Yongji city in Yuncheng city, in August, 2012. After identification and classification, all the specimens were homogenized and centrifuged to acquire supernatant before being inoculated to both C6/36 and BHK21 cells for viral isolation. Positive isolates were identified with arbovirus species-specific primers under RT-PCR, for further sequencing and phylogenetic analysis. Methods A total of 10 455 mosquitoes of 7 species in 4 genuese were collected. The predominant mosquito species in Linyi county was Culex pipens pallens (91.96%, 3 911/4 253), but the one in Yongji city was Culex tritaeniorhynchus (72.85%, 4 518/6 202). A total of 23 strains of viruses were isolated from the mosquito pools. 15 strains from Culex tritaeniorhynchus and Culex pipens pallens were identified as genotype Ⅰ Japanese encephalitis virus (JEV). Four strains from Culex pipens pallens were identified as Culex flavivirus (CxFV). Three strains from Culex pipens pallens were identified as Culex pipiens pallens densovirus (CppDNV). One strain from Armigeres subalbatus and Aedes albopictus was identified as Getah virus (GETV). Conclusion Four kinds of arboviruses were isolated from the mosquito pools, including GETV and CxFV, which were isolated and documented in Shanxi province for the first time. In the city of Yuncheng, Culex tritaeniorhynchus had been the predominant species and major vector for transmitting JEV. Genotype Ⅰ JEV remained the major JEV circulating in the local natural environment.
Key words: Mosquito-borne arboviruses     Japanese encephalitis virus     Getah virus     Culex flavivirus    

2006 年7－8 月在山西省运城市发生流行性乙 型脑炎(乙脑)流行,86%患者为成年人且死亡率很 高[1]。随即有研究者连续两年在当地开展蚊媒病毒 调查工作,但并未分离出乙脑的病原——乙脑病毒 (JEV)[2, 3]。本研究于2012 年夏季再次对山西省运 城市开展蚊媒病毒调查研究,结合多种捕蚊工具采 集标本,以期了解当地主要蚊媒病毒种类及遗传特 性,为当地疾病监测提供依据。 材料与方法

1. 标本采集：2012 年8 月7－12 日在山西省运 城市临猗县和永济市选择果园、猪场、鱼塘等场地,采用光催化诱蚊器、CO2蚊虫诱捕器、诱蚊诱卵器等 工具捕捉蚊虫。于每日17：00 至次日06：00 开启捕 蚊器,仅收集留取活蚊,将蚊虫置于-20 ℃冰箱 30 min,然后在冰排上剔去雄蚊、鉴定蚊种,50～100 只同属的蚊虫为单位装入1 支冻存管。编号记录后 装入液氮中保存待检。

2. 标本处理及病毒分离：将冻存的蚊虫标本倒 入预冷塑料研磨管中,每管加入1.5 ml 研磨液[每 100 ml 研磨液中包含MEM液96 ml,青霉素和链霉 素(PS)2 ml,1%谷氨酰胺(G)1 ml,7.5%碳酸氢钠约 1 ml],使用组织振荡仪充分研磨至匀浆状,以4 ℃ 18 000 g 离心30 min,取上清液接种于生长达到 70%～80%单层的C6/36 和BHK-21 细胞,并分别于 28 ℃和37 ℃的CO2孵箱中培养。逐日观察细胞病 变(CPE),当细胞病变达(约80%)时收获, 以-20 ℃反复冻融3 次使细胞充分裂解释放病毒,离 心后取上清再次接种细胞,连续盲传3 代,有病变者 继续传代至出现规律病变,无病变者舍弃。

3. 病毒分离物的分子生物学鉴定：使用德国 Qiagen 公司的Viral RNA Mini Kit 提取病毒总RNA, 按试剂盒说明书进行操作。使用美国Invitrogen 公 司“SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR”试剂盒及随机引物Oligo(dT20)反转录获得 cDNA。使用宝生物工程(大连)有限公司的GoTaq Green Master Mix 及蚊媒病毒 种属特异引物进行PCR 扩增 (表 1)。扩增产物以1%琼脂糖凝 胶进行电泳,对阳性PCR 产物进 行回收,连接pGEM-T easy 载体 (美国Promega公司)测定序列。

表 1 蚊媒病毒引物信息
表选项

4. 病毒分离物的基因序列进 化分析：使用DNAMAN 软件进 行测序片段的拼接和校正；采用 Clustal X2.09 软件完成核苷酸序 列同源性分析及比对；核苷酸差 异度分析经由DNAStar软件包中 的MegAlign 软件完成；应用 Mega v5.1 软件选择邻接法构建 系统进化树,自展数值为1 000。 结果

1. 蚊虫分布：在山西省运 城市临猗县和永济市的19 个 标本采集点共捕捉蚊虫4 属7 种10 455 只。从总量看,淡色库蚊(47.02%,4 917/ 10 455)和三带喙库蚊(46.43%,4 854/10 455)构成 比重相当,其他种类蚊虫仅占6.49%。临猗县以淡 色库蚊为绝对优势蚊种(91.96%,3 911/4 253),永济 市的主要蚊种为三带喙库蚊(72.85%,4 518/6 202)。

2. 病毒分离：将蚊虫标本分190 批处理,分别接 种C6/36 和BHK-21 细胞培养分离病毒,经连续3 代 (每代培养6 d)感染细胞,获得8 批标本在C6/36 细 胞导致规律CPE(包括聚集、融合、脱落),其中1 株 分离物能导致BHK-21 细胞发生剧烈病变,标本第 二代接种后培养3 d 即显示细胞迅速缩小、边缘不整 齐,4 d 全部细胞脱落。另有15 批标本第三代仅导 致C6/36 细胞轻微CPE(培养至6 d 仍无脱落,仅个 别细胞圆肿),将此培养物转接BHK-21 细胞后一代 即导致剧烈病变,主要表现为第3 天起细胞不规则 缩小,5 d可达到细胞完全脱落。

3. 病毒的分子生物学鉴定：对于发生细胞CPE 的23 株阳性分离物,首先使用蚊媒病毒种属特异引 物进行RT-PCR扩增鉴定。其中19 株属于黄病毒属 成员：包括15 株导致C6/36 细胞轻微病变的JEV (12-LY039、12-YJ016、12-YJ017、12-YJ021、 12-YJ022、12-YJ023、12-YJ030、12-YJ033、 12-YJ038、12-YJ044、12-YJ054、12-YJ075、 12-YJ078、12-YJ082、12-YJ084),以及4 株仅引起C6/36 细胞典型病变的库蚊黄病毒(CxFV) (12-LY005、12-LY015、12-LY035、12-YJ018)；3 株 引起C6/36 细胞病变的分离物为淡色库蚊浓核病毒 (CppDNV)(12-LY002,12-LY003,12-LY006)；1 株 同时导致C6/36 和BHK-21 细胞典型病变的分离物 为盖塔病毒(GETV)(12-YJ020)。所有毒株的背景 信息见表 2。

表 2 蚊媒病毒分离株背景信息
表选项

进一步对15 株JEV 进行E基因片段(JE-955F, JE-2536R)特异扩增,可获得1 500 bp 大小的目标产 物；4 株CxFV 的E 基因特异引物(CxFV-2F, CxFV-2R；CxFV-3F,CxFV-3R；CxFV-4F,CxFV-4R) 扩增均可获得1 200 bp 大小的目标产物。

4. 病毒分离株的系统进化分析：将PCR阳性产 物序列提交至GenBank 进行比对,并下载相关序列 构建数据集,使用邻接法构建系统进化树。

JEV：将新分离的15 株JEV株与不同国家、地区 的JEV毒株E基因序列进行系统进化分析及基因分 型,毒株来源涵盖不同宿主、分离年代和基因型别。 结果显示,JEV 包含5 个基因型别,2012 年山西省 JEV 新分离株均分布于基因Ⅰ型(图 1)。15 株新分 离JEV 高度同源,并与山西省2009 年猪源分离株 SX09S-01 遗传关系最近,位于同一进化簇中。其他 与山西省新分离JEV亲缘关系较接近的毒株包括辽 宁(XJ69)、江西(JX61)和上海的JEV分离株(SH53, SH17M-07)(图 1)。与目前在我国使用的减毒活疫 苗株SA14-14-2 序列相比,山西省新分离JEV 的核 苷酸同源性为87.9%～88.1%,氨基酸同源性达到 97.2%～100.0%；同为基因Ⅰ型,15 株新分离JEV 与 2009 年山西省分离株SX09S-01 和分离自患者脑脊 液的GZ56 的E 基因氨基酸同源性最高,均达 100.0%。基因序列已提交GenBank 注册,序列号： KP216584～KP216598。

图 1 JEV的E基因系统进化分析
图选项

CxFV：分别拼接新分离CxFV 的3 段E 基因核 酸序列,获得4 株病毒全长E 基因序列信息 (GenBank 序列号：KP216580～KP216583)。系统进 化分析结果中所有CxFV株分布在2 个基因型别中, 本研究获得的毒株与其他来自中国大陆地区的分离 株位于同一分支,与2006 年山东分离株 SDDM06-11 进化关系最近,并且与美国、日本株位 于同一个基因型别(GENⅠ)中(图 2)。山西省 CxFV 新分离株之间高度同源,其中12-LY005、 12-LY015 和12-LY035 的E 基因核苷酸、氨基酸同 源性均为100.0% ,与12-YJ018 的同源性分别为 99.9%和99.8%。山西省新分离株与SDDM06-11 核 苷酸和氨基酸同源性最高,分别为99.3%和97.3%。 盖塔病毒(GETV)：将12-YJ020 的E2 基因序列 (GenBank 序列号：KP216576)与其他18 株国内外 GETV及其他甲病毒属成员(Ross River Virus)进行 系统进化及同源性分析,结果显示, 12-YJ020 与上海分离株SH0516 和 SH0515 的核酸亲缘关系及同源性最 高,均为99.3% ,与甘肃分离株 GS10-2 同源性为99.1% 。SH0516、 SH0515 和GS10-2 与12-YJ020 的氨 基酸同源性分别为99.5%、99.5%和 99.2%(图 3)。

图 2 JEV的E基因系统进化分析
图选项

图 3 山西省首次分离 GETV的 E2基因系统进化分析
图选项

CppDNV：基于NS1 和NS2 基因 序列的进化分析结果显示(图 4),山 西省新分离CppDNV 的3 个毒株 (GenBank 序列号：KP216577～ KP216579)核苷酸同源性为100.0%, 与我国其他地方CppDNV 分离株同 属于短颈浓核病毒属 (Brevidensovirus),亲缘关系最近、同 源性也很高,为99.8%～100.0%,其中 与CppDNVJZ16、CppDNVGZWN1、 CppDNVGZWN和XJ058 核酸同源性 达100.0%。

图 4 CppDNV分离株系统进化分析
图选项
讨论 已证实3 种蚊媒病毒及相关疾病在中国存在与 流行,包括JEV、登革热病毒(Dengue virus,DENV)[10] 以及Tahyna 病毒(Tahyna virus, TAHV)[11]。其中JEV 所致的乙脑在 中国造成较大疾病负担[12]。中国＞ 90%乙脑病例发生在＜15 岁儿童,该 病可通过及时接种乙脑疫苗预防[13], 但山西省2006 年发生成年人乙脑流 行[1],仅7－8 月累计报告病例66 例, 病死率为28.8%,94.74%死亡病例分 布在年龄＞50 岁组[1, 14]。JEV 通过 “蚊虫-猪-蚊虫”循环实现其在自然 界中的保存和传播[12],但在当年及随 后开展的运城市多种生境蚊媒病毒 调查工作中,并未分离到JEV[2, 3]。

本研究于2012年夏季再次在山西 省运城市进行蚊媒病毒监测,共获得 包括JEV 在内的4 种、23 株病毒分离 物。其中,GETV广泛分布于东南亚及 澳大利亚北部等太平洋沿岸地区[15], 能够在猪、马等多种动物中引发自限 性疾病[10],在我国已先后从河北、云 南、甘肃等省分离到[8, 16],本研究分离 的12-YJ020 为首次在山西省分离报 道GETV,该毒株与上海(SH0515、 SH0516)、甘肃(GS10-2)分离株的E2 基因亲缘关系最为接近,鉴于E2 编码 蛋白是病毒与宿主细胞受体相互作 用、诱导产生中和抗体的最重要表面 蛋白,提示山西省新分离GETV 与以 上毒株在致病性方面表现更为相 似。Wang 等[9]于2006 年从山东省首 次分离到1 株昆虫特异性病毒CxFV (编号SDDM06-11),该种病毒仅能在 C6/36 细胞扩增导致病变,不能在哺 乳动物细胞中扩增。本研究首次从 山西省分离到4 株CxFV,同样仅能在 C6/36 细胞中导致CPE,较典型特征 表现为细胞融合,系统进化分析显 示,山西省分离株与SDDM06-11 同 源性最高,提示CxFV 在我国已经呈 现扩展分布趋势,且毒株变异度较 小。2007 年付士红等[3]从山西省南部蚊虫中分离到 4 株CppDNV,本次仍能分离到该种病毒,提示 CppDNV在山西省南部地区自然界中稳定存在。E 基因编码蛋白决定着JEV 毒力及抗原性,比较2012年山西省运城市的JEV 毒株,发现均为基因Ⅰ型 JEV,且新分离株与疫苗株的E基因关键位点未见异 常突变,提示分离株毒力并未降低而神经侵入力同 样较弱,可以说明当地自然界中存在乙脑的病原体, 并且基因Ⅰ型JEV已成为当地优势毒种。

代培芳等[17]于2006 和 2007 年对山西省运城市进行 媒介蚊虫调查,临猗县2006 年 9 月捕获的三带喙库蚊和淡色 库蚊分别占59.4% 和38.7% , 2007 年8 月分别为77.7% 和 22.1%。2012 年8 月,除蚊虫总 量减少外,淡色库蚊已取代三 带喙库蚊成为当地绝对优势蚊 种(91.96%),媒介的大幅改变 可能导致其携带相应病毒的种 类和数量变化。从临猗县蚊虫 分离的7 株病毒中仅1 株为 JEV(12-LY039),但该毒株分 离自淡色库蚊,且标本来源于 既往有乙脑病例的农户家的猪 舍,提示当地仍然存在可致病 JEV。本研究中永济市蚊虫相 对较多,三带喙库蚊和淡色库 蚊分别占72.9%和16.2%,相对 于2007 年同期数据亦有改变 (三带喙库蚊57.6%,淡色库蚊 40.0%)[17],所分离毒株中JEV 占87.5%(14/16)。三带喙库蚊 对JEV 高度易感[18],本研究中 携带JEV的媒介以三带喙库蚊 为主,也包含淡色库蚊,且分离 到JEV 毒株的标本均来自猪 场,提示相关地方仍需严格做 好对猪场等环境的防蚊灭蚊及 卫生管理工作,防患于未然。

[感谢运城市疾病预防控制中心 (CDC)、临猗县CDC 及永济市CDC 对 本项目的支持]

参考文献
[1] Wang LH, Fu SH, Wang HY, et al. Japanese encephalitis outbreak, Yuncheng, China, 2006[J]. Emerg Infec Dis, 2007, 13(7):1123-1125.
[2] Li MH, Meng WS, Fu SH, et al. Arbovirus investigation in some regions of Shanxi province in 2007[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2009, 23(1):32-34. (in Chinese)李铭华, 孟维珊, 付士红, 等. 2007年山西省部分地区虫媒病毒调查[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2009, 23(1):32-34.
[3] Fu SH, Li MH, Meng WS, et al. Isolation and identification of Arbovirus in southern part of Shanxi province, 2006[J]. 付士红, 李铭华, 孟维珊, 等. 2006年山西省南部地区虫媒病毒分离鉴定[J]. 疾病监测, 2010, 25(2):95-98.
[4] Kuno G. Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses[J]. J Virol Methods, 1998, 72(1):27-41.
[5] Billoir F, Attoui H, Simon S, et al. Molecular diagnosis of group B coltiviruses infections[J]. J Virol Methods, 1999, 81(1/2):39-45.
[6] Zhai YG, Lyu XJ, Sun XH, et al. Isolation and characterization of the full coding sequence of a novel densovirus from the mosquito Culex pipiens pallens[J]. J Gen Virol, 2008, 89(Pt 1):195-199.
[7] Wang HY, Li YX, Liang XF, et al. Japanese encephalitis in mainland China[J]. Jpn J Infect Dis, 2009, 62(5):331-336.
[8] Zhai YG, Wang HY, Sun XH, et al. Complete sequence characterization of isolates of Getah virus (genus Alphavirus, family Togaviridae) from China[J]. J Gen Virol, 2008, 89(Pt 6):1446-1456.
[9] Wang HY, Wang HY, Fu SH, et al. Isolation and identification of a distinct strain of Culex flavivirus from mosquitoes collected in Mainland China[J]. Virol J, 2012, 9(1):73.
[10] Liang GD. Newly isolated arboviruses and their vectors in mainland China[J]. Chin J Vector Biol Control, 2010, 21(3):181-183. (in Chinese)梁国栋. 我国新分离虫媒病毒及其传播媒介[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2010, 21(3):181-183.
[11] Li WJ, Wang JL, Li MH, et al. Mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Qinghai-Tibet Plateau-focused on the Qinghai area, China[J]. Am J Trop Med Hyg, 2010, 82(4):705-711.
[12] Zheng YY, Li MH, Wang HY, et al. Japanese encephalitis and Japanese encephalitis virus in mainland China[J]. Rev Med Virol, 2012, 22(5):301-322.
[13] Zheng JS, Zhou YQ, Wang HQ, et al. The role of the China Experts Advisory Committee on Immunization Program[J]. Vaccine, 2010, 28 Suppl 1:S84-87.
[14] Yin ZD, Liang XF, Li YX, et al. Investigation and analysis on the Japanese B encephalitis epidemic in Yuncheng prefecture, Shanxi province, 2006[J]. Chin J Vaccin Immunol, 2007, 13(3):270-273. (in Chinese)尹遵栋, 梁晓峰, 李艺星, 等. 运城市2006年流行性乙型脑炎疫情调查分析[J]. 中国计划免疫, 2007, 13(3):270-273.
[15] Bryant JE, Crabtree MB, Nam VS, et al. Isolation of arboviruses from mosquitoes collected in northern Vietnam[J]. Am J Trop Med Hyg, 2005, 73(2):470-473.
[16] Wang HQ, Liu WB, Yang DR, et al. Isolation and identification of arboviruses in Hebei province[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2006, 20(1):52-55. (in Chinese)王焕琴, 刘卫兵, 杨冬荣, 等. 河北省虫媒病毒分离鉴定[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2006, 20(1):52-55.
[17] Dai PF, Zhao JY, Kong XS, et al. A survey on Japanese encephalitis mosquito vectors in some regions of Shanxi province[J]. Chin J Vector Biol Control, 2010, 21(1):51-53. (in Chinese)代培芳, 赵俊英, 孔祥盛, 等. 山西省部分地区流行性乙型脑炎媒介蚊虫调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2010, 21(1):51-53.
[18] Deng SZ, Zhang HL, Li JM, et al. The maintenance, spread and vectors for Japanese encephalitis virus in nature[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2008, 22(2):140-142. (in Chinese)邓淑珍, 张海林, 李金梅, 等. 流行性乙型脑炎病毒在自然界的保存与扩散及传播媒介[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2008, 22(2):140-142."