本研究利用中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室选出的15对多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）引物应用于甘肃省鼠疫菌株的分析。

1. 材料与方法：

（1）材料：202株鼠疫菌均分离于1962－2009年甘肃省鼠疫疫源地境内，保存于甘肃省疾病预防控制中心鼠疫菌库。

（2）MLVA位点选取和PCR引物设计：将鼠疫菌染色体分成68个共线性区段（板块），板块之间可以互相移动，但板块内部稳定（内部不会发生位置和方向的改变）。将每个板块序列与目前已完成全基因组测序的9株鼠疫菌染色体序列进行BLAST比对（除CO92外）。根据比对结果，结合TRF（tandem repeat finder）软件，寻找每个板块内可以用于分型的MLVA位点，然后以完成全基因组测序的首株鼠疫菌株CO92（美国）为模板，比较重复基序拷贝数有无差别，选出差异位点15个。MLVA位点确定后，在其两侧的适当部位设计引物，序列见表 1。

表 1 鼠疫菌MLVA引物序列

表选项

（3）方法：根据苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA并进行PCR反应。引物MLV1、MLV2、MLV3、MLV4的PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶电泳，其余11对引物的PCR产物使用3%琼脂糖凝胶电泳。对可疑PCR结果采取多次重复实验确定。对扩增条带大小相同的菌株，每对引物随机挑选2～3株PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果同CO92菌株的相应序列进行比对，最后确定每个实验菌株的重复数。通过BioNumerics 5.0软件对数据进行聚类分析，绘制聚类图。

2. 结果与分析：聚类分析显示，甘肃省202株鼠疫菌分成两群，菌株198272单独成为一个群，其他201株菌（9株甘宁黄鼠型、18株阿尔金山型、47株祁连山型和127株青藏高原型鼠疫菌）聚集成为另一群，菌株未呈现地点和年代聚集性等特征。菌株198272生态型为祁连山型，与其他祁连山型的47株鼠疫菌相比独立成为一个群，它们同为旱獭鼠疫疫源地且亲缘关系较近，但是基因型之间存在较大差异。本研究选择的15个位点未能将古典型和中世纪型、不同生化型的鼠疫菌区分开。MLVA 分析位点选择对实验结果影响甚远，Pourcel等^[1]选用25个位点将180株鼠疫菌分成61个基因组型，而且3个生物型分别位于3个主要分支上，并发现中世纪型菌株存在多态性。Klevytska等^[2]采用46个位点，利用毛细管电泳方法成功将94株鼠疫菌进行分型，正确反映了古典型、中世纪型、东方型和田鼠型菌株之间的进化关系。Li等^[3]从88个MLVA位点筛选出“14＋12”位点用于鼠疫菌快速溯源，这些位点互为补充，提高了综合分型的分辨率，区分了近缘菌株，降低了MLVA位点突变造成异源相似的影响，缩短了检测时间和成本。本研究所用MLVA位点未能对甘肃省鼠疫菌进行分型，有必要借鉴上述研究者所选位点进一步研究。