金黄色葡萄球菌（金葡菌）能够产生溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素等多种毒力因子，引起一系列感染性疾病^[1]。近年来，由于耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的大量出现，使疾病治疗变得更加困难和棘手^[2]。MRSA作为医院感染的重要病原菌，得到越来越多的关注。由于抗生素滥用，我国已经成MRSA高度流行的国家。由于MRSA起源、进化和流行具有区域特点，有必要对患者来源和食品来源菌株进行分子生物学研究。本研究对2008－2012年马鞍山地区分离的210株金葡菌的肠毒素和溶血素基因进行检测，并对34株MRSA及3株甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）进行多位点序列分型（MLST）分析，探讨菌株间遗传进化关系。 材料与方法

1. 实验菌株：共210株，其中食品来源菌株127株，分别为2010年40株、2011年57株、2012年30株；患者来源菌株83株，分别为2008年55株、2011年20株、2012年8株。所有菌株均为革兰阳性菌、过氧化氢酶和血浆凝固酶阳性，经细菌自动仪鉴定为金葡菌；同时对每株菌株耐热核酸酶基因进行PCR检测以进一步确定。

2. 肠毒素检测：使用法国梅里埃公司生产的miniVIDAS全自动荧光免疫分析仪及肠毒素检测试剂盒检测肠毒素基因。菌株经肉汤培养过夜后，离心，取上清液上机。操作按仪器手册进行。同时设置阳性和阴性对照。

3. 溶血素基因与MLST基因的检测：根据在NCBI上查的序列，利用Primer 5.0软件，设计溶血素基因nuc、hla、hlb以及MLST的引物序列，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表 1。

表 1　金葡菌溶血素及MLST基因引物

表选项

溶血素基因PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，49 ℃ 40 s（hla基因）或54 ℃ 40 s（hlb基因），72℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。MLST分析的PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物进行琼脂凝胶电泳后成像。

4. MLST分析：通过PCR扩增金葡菌arcc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi、yqil七个管家基因，将扩增产物直接送公司纯化和双向测序。测序结果用Vector NTI suite 6软件进行分析和校对后，将7个管家基因序列进行网上数据库比对，得到每个菌株的等位基因号。将已有的7个基因序列作为参照，使用DNAStar的MegAlign软件对序列进行分析，并将整理好的序列上传至MLST数据库网站（http：//saureus.mlst.net），得到每个等位基因相对应的序号并获得序列型（ST），根据eBURST对ST进行亲缘性分析。

5. 甲氧西林抗性检测和药敏试验：甲氧西林抗性检测采用纸片扩散法，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）的标准^[3]，利用苯唑青霉素平板筛选试验进行检测，在平板上有单菌落生长，则判定为苯唑青霉素或甲氧西林抗性阳性。每个菌株重复测定3次，以金葡菌ATCC29213作为质控菌株。药敏试验按CLSI标准，采用琼脂稀释法，制备含相应抗生素系列稀释梯度的MH琼脂平板。抗生素包括青霉素、苯唑西林、庆大霉素、红霉素、去甲万古霉素、四环素、氯霉素、利福平、环丙沙星、氯林可霉素、呋喃妥因。结果判断以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 结果

1. 甲氧西林抗性检测：采用纸片扩散法对210株菌株进行检测，51株为MRSA（24.3%），包含食品来源25株（19.7%，25/127）及患者来源26株（31.3%，26/83）。

2. 肠毒素检测：210株金葡菌中107株为肠毒素阳性（50.9%）。不同年份菌株的肠毒素阳性率分别为2008年54.6%（30/55），2009年42.5%（17/40），2011年57.1%（44/77）和2012年42.1%（16/38），不同年份之间肠毒素阳性率差异无统计学意义（P＝0.284）。51株MRSA中有46株肠毒素阳性（90.2%），其中25株食品来源MRSA有22株阳性（88.0%）；26株患者来源MRSA中24株阳性（92.3%），差异无统计学意义（P＝0.963）。

3. 溶血素基因分布：

（1）nuc：210株菌株经PCR扩增均检测到nuc基因，阳性率为100%。

（2）hla、hlb：根据PCR检测结果，210株菌中198株含有hla、hlb中的1～2种基因（94.3%），其中hla、hlb同时检出率为31.4%，hla基因检出率为32.4%，hlb基因检出率为30.5%（表 2）。统计学分析显示，食品来源和患者来源菌株各基因阳性率差异无统计学意义（χ²＝2.807，P＝0.422）。食品来源的127株菌株中检出溶血素基因120株，检出率为94.5%；83株患者来源菌株中78株检出溶血素基因，检出率为94.0%，见表 3。51株MRSA检出hla、hlb中的1～2种基因，检出率为100%。

表 2　马鞍山地区210株MRSA溶血素基因检测

表选项

表 3　马鞍山地区51株MRSA药敏结果

表选项

4. MLST：选取34株MRSA和3株MSSA进行MLST分析，得到14个等位基因，11个ST，以ST239为主（43.2%），ST5次之（16.2%），其他型别为散发状态，分别是ST7（5-4-1-4-4-6-3）为10.8%，ST188（3-1-1-8-1-1-1）为8.1%，ST88（22-1-14-23-12- 4-31）为8.1%，其余型别（ST1、97、243、585、630和1281）均为2.7%，见图 1。

图 1　马鞍山地区37株MRSA MLST聚类

图选项

菌株的ST比较分散，主要以ST239为主，占47.1%（16/34），其次为ST5，占17.6%（6/34），这两个主要型别的菌株均为MRSA。在ST188、ST1281和ST7三种ST的菌株中各有1株是耐甲氧西林凝固酶阴性的菌株（MRCNS），其余34株菌为MRSA，见图 2。

图 2　马鞍山地区MRSA和MSSA的MLST

图选项

17株患者来源菌株有6个ST，以ST239为主要型别（35.3%，6/17），其次为ST5（29.4%，5/17）；20株食品来源菌株有9个型别，以ST239为主（45.0%，9/20），其次为ST7（15.0%，3/20）。在几个主要的ST中菌株来源既包括患者来源也包括食品来源，见图 3。

图 3　马鞍山地区不同来源金葡菌的MLST

图选项

eBURST软件分析显示（图 4），ST585、ST239以及ST630亲缘关系较近，其余ST之间亲缘关系较远。

图 4　马鞍山地区37株MRSA的eBURST分析

图选项

5. 药敏试验：食品和患者来源的菌株对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、庆大霉素和红霉素的耐药率最高，均高于90.0%，耐药率较高的为四环素、环丙沙星、氯林可霉素和利福平，均高于50.0%，所有菌株对氯霉素、呋喃妥因和去甲万古霉素有较低的耐药率。食品和患者来源菌株耐药率差异无统计学意义，见表 3。 讨论

金葡菌为人类重要的致病菌之一，能够产生溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素等多种毒力因子，可引起人皮肤软组织感染、肺炎和中毒性休克综合征等一系列感染性疾病，严重危害着人类的健康^[4]。本研究对210株金葡菌溶血素基因检测，阳性率达94.3%，说明溶血素在该菌中普遍存在。对51株MRSA进行溶血素检测，发现均携带hla或hlb基因。因本研究菌株数较少，MRSA耐药是否与携带溶血素基因有关，有待进一步研究证实。

近年来，随着抗生素滥用，动物源性MRSA菌株在全世界范围内已有报道^[5]。本研究中20株食品来源菌株分离自马鞍山地区的禽畜类和水产品，17株则分离自住院患者。根据37株菌株的MLST结果可以看出，在这些菌株中，共有11个ST，以ST239为主要型别，ST5次之。根据20株食品来源菌株的MLST进行分析，有9个型别，以ST239为主要型，ST7次之；金葡菌是社区获得性感染和医院内感染的主要致病菌之一，因此国内外的报道多以分离自患者的菌株为多见，而对于分离自食品的菌株较少。本次食品来源菌株以ST239为主要型别。由于金葡菌也是食源性致病菌，有必要对我国食品中MRSA的流行情况进行MLST分析，以建立统一的分子数据库。此外，17株患者来源菌株则分布为6个型别，也以ST239为主要型，ST5次之。根据我国相关医院内MRSA的流行病学调查发现，ST5和ST239型是我国医院感染中最为常见^[6]。其中ST239-MRSA 在阿根廷^[7]、印度^[8]和中国香港^[9]等地也报道ST239为主要克隆群。而ST5这一克隆在日本^[10]和韩国^[11]也是其优势菌群，这些报道都与本研究结果一致。

从结果中可以看出，11种ST亲缘关系较远，提示不同来源的37株菌存在克隆多样性，34株MRSA共分为10个ST，以ST239和ST5为优势型别；而3株MSSA分别为ST188、ST1281和ST7，提示ST239和ST5可以作为MRSA鉴定的候选型别。

药敏试验结果显示，51株MRSA对青霉素、苯唑西林、氨苄西林的耐药率均高于95%，对庆大霉素、红霉素、四环素的耐药率高于90%，仅对去甲万古霉素、呋喃妥因有较好的敏感性，提示MRSA呈多重耐药的情况较为严重。目前，由于抗生素在临床治疗中长期大量使用，致使MRSA已经成为医院内及社区获得性感染的主要致病菌，其来源普遍，检出频繁，致病力和耐药性也越来越强。同时，食源性动物中MRSA的产生也与抗菌药物在养殖场的广泛应用密切相关，长期低剂量的抗菌药物添加到饮水或饲料中，可能是导致细菌产生耐药性的主要原因之一^[12]。因此，临床上应进一步控制和对症使用抗生素治疗MRSA引起的疾病，在养殖业中，应合理规范动物饲料抗生素添加剂的使用，加强抗生素的管理及耐药性的监测，以防止多耐药菌株的产生。