类鼻疽（melioidosis）是由类鼻疽伯克霍尔德菌 （Burkholderia pseudomallei，类鼻疽伯克菌）引起的一种严重 热带传染病^[1]。海南地区类鼻疽流行病学调查发现，三亚等 地人群中类鼻疽血清阳性率高达13.7% ^[2]；但当地确诊的类 鼻疽病患者相对较少。本研究在海南省南部地区进行环境 中类鼻疽伯克菌及与其相似的泰国伯克菌（Burkholderia thailandensis）调查。

1.材料与方法：

（1）样品采集与菌株分离培养：参照“国际类鼻疽工作 组”推荐的环境类鼻疽伯克菌采样原则及分离方法^[1]，于 2014年4月在海南省南部东方、乐东、三亚、陵水、万宁等县 （市）的20个采样点共采集稻田土、污水等样品70份，送实验 室进行菌株分离培养。

（2）细菌学检测：疑似菌落转种于血平板及Ashdown选 择平板，35℃培养48～72h后观察菌落形态特征；革兰染色 镜检；使用类鼻疽抗原检测胶体金试剂进行血清学鉴定；将 疑似菌株接种于API20NE生化反应板，29℃孵育24h、48h 后，读取结果并记录。

（3）16S rDNA序列分析：参照文献^[3]，通过特异16S rRNA基因对疑似菌株进行鉴定。PCR扩增及测序引物： 16S_27F（5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′）；16S_ 1492R（5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）。

（4）多位点序列分型（MLST）：参照文献^[4]，收集菌株 培养物并提取染色体DNA，然后进行7个等位基因的PCR 扩增及测序。PCR采用TaKaRa LA Taq with GC Buffer系 统，50μl反应体系。扩增条件：95℃2min；94℃40s，58℃ 40s，72℃40s，30个循环；72℃7min。PCR产物双向测序， 测序结果校对后递交类鼻疽伯克菌MLST数据库（http：// bpseudomallei.mlst.net），获得等位基因序列号并确定菌株序 列型（ST）。

（5）毒力因子检测：利用PCR检测分离菌株中三型分泌 系统（type Ⅲsecretion system，TTSS1）、伯克菌致死因子 （BurkholderiaLethal Factor1，BLF1）等类鼻疽伯克菌毒力基 因的携带情况。TTSS1引物：BpTT4176F（5′-CGT CTC TAT ACT GTC GAG CAA TCG-3′），BpTT4290R（5′-CGT GCA CAC CGG TCA GTA TC-3′）；BLF1引物：BPSL1549F （5′-CGC TGC TGG AGG GTG TAT GT-3′），BPSL1549R （5′-CCG GCA CCT TGA ATG TCT TTC-3′）。PCR反应体 系及扩增条件同上，以类鼻疽伯克菌BP003、BP010为阳性 对照。

2.结果：

（1）菌株分离与细菌学鉴定：70份环境样品中共分离出 4株类鼻疽伯克菌/泰国伯克菌疑似细菌：HN14、HN44、 HN61、HN82；采样地点、来源等见表 1。Ashdown选择平板 上，分离细菌为粉红或浅紫色扁平菌落，周边皱褶，有金属光 泽；血平板上，为灰白色菌落，可见α溶血，有金属光泽。革兰 染色镜检：革兰阴性短杆菌。类鼻疽抗原血清学鉴定，4株细 菌均为阳性。生化鉴定：4株菌反应结果的数字图谱为 1157577，与类鼻疽伯克菌相比，仅“阿拉伯糖同化反应”结果 不同（表 1）。

表 1 4株泰国伯克菌的表型特征、MLST型别、毒力基因携带情况

表选项

（2）16S rDNA序列分析：4株细菌的16S rDNA序列（约 1380bp）与泰国伯克菌标准株（E264）16S rDNA序列同源性 最高，分别为100.0%、100.0%、99.9%和100.0%；与类鼻疽伯克菌（K96243）16S rDNA序列同源性为99.1%、99.1%、99.0% 和99.1%，差异碱基数分别为12、12、13和12。

（3）MLST：4株菌分为2种ST型：HN14为ST76型（6， 10，15，8，10，14，9），其余3株为ST345型（6，10，15，8，10，14， 8）。ST76与ST345相似度高：7个等位基因位点中仅ndh不 同。2种序列型与泰国类鼻疽伯克菌标准菌株E264（ST80： 6，10，16，8，10，14，8）的遗传相似度较高：分别在2个位点 （gmhD，ndh）和1个位点（gmhD）存在差异。

（4）毒力基因携带情况：分离菌株均不携带TTSS1及 BLF1相关基因，见图 1。

注：1～4/7～10分别为HN14、HN44、HN61和HN82；阳性对照： 5、11为BP003，6、12为BP010；M：DL2000Marker图 1 TTSS1、BLF1相关基因的PCR扩增电泳结果

图选项

3. 讨论：类鼻疽伯克菌与鼻疽伯克菌是伯克菌属中最重 要的2种病原菌，分别引起类鼻疽和鼻疽2种烈性传染病。 泰国伯克菌是与其遗传距离最为接近的不致病伯克菌^[4]，三 者统称为类鼻疽伯克菌群（Burkholderia pseudomallei complex）。

本研究首次在海南省类鼻疽流行区分离到泰国伯克菌， 其流行病学意义：其一，4个泰国伯克菌阳性采样点所在镇 中，有2个（三亚海棠湾镇、乐东县抱由镇）近年曾出现类鼻 疽病例，提示泰国伯克菌与类鼻疽伯克菌的分布存在重叠 性。在类鼻疽流行区，类鼻疽伯克菌与泰国伯克菌共存可能 是一种普遍现象。其二，根据形态特征、抗原血清学鉴定、生 化反应等传统方法鉴定泰国伯克菌的特异性较差、结果不稳 定，提示泰国伯克菌与类鼻疽伯克菌难于区分，在病原学调 查过程中要注意鉴别，防止误判。与此相比，16S rDNA序列 分析、MLST、毒力基因特异PCR等基于DNA序列的鉴定方 法更加有效。其三，使用类鼻疽伯克菌特异抗原检测试剂进 行血清学鉴定时，4株泰国伯克菌均为阳性，证实二者存在抗 原交叉反应。以往研究中报道海南省南部地区人群抗类鼻 疽伯克菌血清阳性率较高可能受此影响。

Ma等^[5]曾经在广西壮族自治区类鼻疽流行区的土壤中 分离到类鼻疽伯克菌。本研究采用相似方法进行检测，未在 海南省流行地区分离到该菌。究其原因，可能与调查期间处 于旱季，降雨稀少，环境中类鼻疽伯克菌密度较低、每个采样 地点采集样品数相对较少等因素有关。尚不能排除采样地 区环境中存在类鼻疽伯克菌的可能性。