中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (1): 97-98   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.01.023
中华医学会主办。
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郑霄, 陈海, 朱雄, 蔡虹, 黎礼达, 李欢, 尤鑫, 平静, 夏连续, 李伟. 2014.
Zheng Xiao, Chen Hai, Zhu Xiong, Cai Hong, Li Lida, Li Huan, You Xin, Ping Jing, Xia Lianxu, Li Wei. 2014.
海南省类鼻疽流行区分离出泰国伯克霍尔德菌
Discovery of Burkholderia thailandensis isolates from melioidosis endemic areas of Hainan, China
中华流行病学杂志, 2015, 36(1): 97-98
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(1): 97-98
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.01.023

文章历史

投稿日期:2014-08-15
海南省类鼻疽流行区分离出泰国伯克霍尔德菌
郑霄1, 陈海2, 朱雄2, 蔡虹1, 黎礼达2, 李欢2, 尤鑫3, 平静3, 夏连续1 , 李伟1     
1. 102206 北京, 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室;
2. 三亚市人民医院;
3. 北京市疾病预防控制中心
关键词泰国伯克霍尔德菌     类鼻疽病    
Discovery of Burkholderia thailandensis isolates from melioidosis endemic areas of Hainan, China
Zheng Xiao1, Chen Hai2, Zhu Xiong2, Cai Hong1, Li Lida2, Li Huan2, You Xin3, Ping Jing3, Xia Lianxu1 , Li Wei1     
1 State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
2 Sanya People's Hospital;
3 Beijing Center for Disease Control and Prevention
Key words: Burkholderia thailandensis     Melioidosis    

类鼻疽(melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德菌 (Burkholderia pseudomallei,类鼻疽伯克菌)引起的一种严重 热带传染病[1]。海南地区类鼻疽流行病学调查发现,三亚等 地人群中类鼻疽血清阳性率高达13.7% [2];但当地确诊的类 鼻疽病患者相对较少。本研究在海南省南部地区进行环境 中类鼻疽伯克菌及与其相似的泰国伯克菌(Burkholderia thailandensis)调查。

1.材料与方法:

(1)样品采集与菌株分离培养:参照“国际类鼻疽工作 组”推荐的环境类鼻疽伯克菌采样原则及分离方法[1],于 2014年4月在海南省南部东方、乐东、三亚、陵水、万宁等县 (市)的20个采样点共采集稻田土、污水等样品70份,送实验 室进行菌株分离培养。

(2)细菌学检测:疑似菌落转种于血平板及Ashdown选 择平板,35℃培养48~72h后观察菌落形态特征;革兰染色 镜检;使用类鼻疽抗原检测胶体金试剂进行血清学鉴定;将 疑似菌株接种于API20NE生化反应板,29℃孵育24h、48h 后,读取结果并记录。

(3)16S rDNA序列分析:参照文献[3],通过特异16S rRNA基因对疑似菌株进行鉴定。PCR扩增及测序引物: 16S_27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′);16S_ 1492R(5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。

(4)多位点序列分型(MLST):参照文献[4],收集菌株 培养物并提取染色体DNA,然后进行7个等位基因的PCR 扩增及测序。PCR采用TaKaRa LA Taq with GC Buffer系 统,50μl反应体系。扩增条件:95℃2min;94℃40s,58℃ 40s,72℃40s,30个循环;72℃7min。PCR产物双向测序, 测序结果校对后递交类鼻疽伯克菌MLST数据库(http:// bpseudomallei.mlst.net),获得等位基因序列号并确定菌株序 列型(ST)。

(5)毒力因子检测:利用PCR检测分离菌株中三型分泌 系统(type Ⅲsecretion system,TTSS1)、伯克菌致死因子 (BurkholderiaLethal Factor1,BLF1)等类鼻疽伯克菌毒力基 因的携带情况。TTSS1引物:BpTT4176F(5′-CGT CTC TAT ACT GTC GAG CAA TCG-3′),BpTT4290R(5′-CGT GCA CAC CGG TCA GTA TC-3′);BLF1引物:BPSL1549F (5′-CGC TGC TGG AGG GTG TAT GT-3′),BPSL1549R (5′-CCG GCA CCT TGA ATG TCT TTC-3′)。PCR反应体 系及扩增条件同上,以类鼻疽伯克菌BP003、BP010为阳性 对照。

2.结果:

(1)菌株分离与细菌学鉴定:70份环境样品中共分离出 4株类鼻疽伯克菌/泰国伯克菌疑似细菌:HN14、HN44、 HN61、HN82;采样地点、来源等见表 1。Ashdown选择平板 上,分离细菌为粉红或浅紫色扁平菌落,周边皱褶,有金属光 泽;血平板上,为灰白色菌落,可见α溶血,有金属光泽。革兰 染色镜检:革兰阴性短杆菌。类鼻疽抗原血清学鉴定,4株细 菌均为阳性。生化鉴定:4株菌反应结果的数字图谱为 1157577,与类鼻疽伯克菌相比,仅“阿拉伯糖同化反应”结果 不同(表 1)。

表 1 4株泰国伯克菌的表型特征、MLST型别、毒力基因携带情况

(2)16S rDNA序列分析:4株细菌的16S rDNA序列(约 1380bp)与泰国伯克菌标准株(E264)16S rDNA序列同源性 最高,分别为100.0%、100.0%、99.9%和100.0%;与类鼻疽伯克菌(K96243)16S rDNA序列同源性为99.1%、99.1%、99.0% 和99.1%,差异碱基数分别为12、12、13和12。

(3)MLST:4株菌分为2种ST型:HN14为ST76型(6, 10,15,8,10,14,9),其余3株为ST345型(6,10,15,8,10,14, 8)。ST76与ST345相似度高:7个等位基因位点中仅ndh不 同。2种序列型与泰国类鼻疽伯克菌标准菌株E264(ST80: 6,10,16,8,10,14,8)的遗传相似度较高:分别在2个位点 (gmhD,ndh)和1个位点(gmhD)存在差异。

(4)毒力基因携带情况:分离菌株均不携带TTSS1及 BLF1相关基因,见图 1

注:1~4/7~10分别为HN14、HN44、HN61和HN82;阳性对照: 5、11为BP003,6、12为BP010;M:DL2000Marker图 1 TTSS1、BLF1相关基因的PCR扩增电泳结果

3. 讨论:类鼻疽伯克菌与鼻疽伯克菌是伯克菌属中最重 要的2种病原菌,分别引起类鼻疽和鼻疽2种烈性传染病。 泰国伯克菌是与其遗传距离最为接近的不致病伯克菌[4],三 者统称为类鼻疽伯克菌群(Burkholderia pseudomallei complex)。

本研究首次在海南省类鼻疽流行区分离到泰国伯克菌, 其流行病学意义:其一,4个泰国伯克菌阳性采样点所在镇 中,有2个(三亚海棠湾镇、乐东县抱由镇)近年曾出现类鼻 疽病例,提示泰国伯克菌与类鼻疽伯克菌的分布存在重叠 性。在类鼻疽流行区,类鼻疽伯克菌与泰国伯克菌共存可能 是一种普遍现象。其二,根据形态特征、抗原血清学鉴定、生 化反应等传统方法鉴定泰国伯克菌的特异性较差、结果不稳 定,提示泰国伯克菌与类鼻疽伯克菌难于区分,在病原学调 查过程中要注意鉴别,防止误判。与此相比,16S rDNA序列 分析、MLST、毒力基因特异PCR等基于DNA序列的鉴定方 法更加有效。其三,使用类鼻疽伯克菌特异抗原检测试剂进 行血清学鉴定时,4株泰国伯克菌均为阳性,证实二者存在抗 原交叉反应。以往研究中报道海南省南部地区人群抗类鼻 疽伯克菌血清阳性率较高可能受此影响。

Ma等[5]曾经在广西壮族自治区类鼻疽流行区的土壤中 分离到类鼻疽伯克菌。本研究采用相似方法进行检测,未在 海南省流行地区分离到该菌。究其原因,可能与调查期间处 于旱季,降雨稀少,环境中类鼻疽伯克菌密度较低、每个采样 地点采集样品数相对较少等因素有关。尚不能排除采样地 区环境中存在类鼻疽伯克菌的可能性。

参考文献
[1] Limmathurotsakul D, Dance DA, Wuthiekanun V, et al. Systematic review and consensus guidelines for environmental sampling of Burkholderia pseudomallei[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(3): e2105.
[2] Yang S. Melioidosis research in China[J]. Acta Trop, 2000, 77(2):157-165.
[3] Brett PJ, DeShazer D, Woods DE. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-like species[J]. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48(Pt 1):317-320.
[4] Godoy D, Randle G, Simpson AJ, et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(5): 2068- 2079.
[5] Ma G, Zheng D, Cai Q, et al. Prevalence of Burkholderia pseudomallei in Guangxi, China[J]. Epidemiol Infect, 2010, 138(1):37-39.