中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (1): 61-66   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.01.015
中华医学会主办。
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张佳峰, 杨介者, 潘晓红, 郭志宏, 丁晓贝, 徐云, 黄晶晶, 夏燕. 2014.
hang Jiafeng, Yang Jiezhe, Pan Xiaohong, Guo Zhihong, Ding Xiaobei, Xu Yun, Huang Jingjing, Xia Yan. 2014.
浙江省男男性行为人群HIV-1新近感染者的毒株亚型和传播簇研究
HIV-1 subtype diversity and transmission clusters among men having sex with men who recently got HIV-l infection, in Zhejiang province
中华流行病学杂志, 2015, 36(1): 61-66
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(1): 61-66
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.01.015

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投稿日期:2014-07-25
浙江省男男性行为人群HIV-1新近感染者的毒株亚型和传播簇研究
张佳峰, 杨介者, 潘晓红 , 郭志宏, 丁晓贝, 徐云, 黄晶晶, 夏燕    
310051 杭州, 浙江省疾病预防控制中心
摘要目的 了解浙江省MSM中的HIV-1新近感染者的毒株亚型组成和传播特征. 方法 233例2011年新报告的MSM感染者经BED捕获酶免试验(BED-CEIA)检测为新近感染, 其中107例纳入分子流行病学研究, 收集血浆样本提取RNA核酸, 用反转录/巢式PCR扩增HIV病毒的pol基因片段, 测序后进行生物信息学分析. 结果 107例研究对象与当年MSM新近感染者在社会人口学特征上差异无统计学意义. 序列获得率为94.4%(101/107), CRF01_AE占比最高(62.4%), 其次是CRF07_BC(31.7%), 另有3例B亚型, 1例CRF55_01B和2例独特重组型. 毒株在系统进化树上主要分为CRF01_AE的簇1、簇2和CRF07_BC的簇3, 杭州地区的毒株散播于各个进化分支. 共发现10个传播簇, 80%涉及≥2个的地市, 90%与现住址为杭州的病例有关;共发现有3个样本各存在一个监测性耐药突变, 分别为M46I、T215S和G190A, 传播性耐药率为2.97%. 结论 浙江省MSM的HIV亚型呈现复杂性趋势, 但传播性耐药处于低度流行水平;HIV的跨地区传播较为普遍, 杭州在地域上可能发挥着核心传播作用, 全省已形成混杂交织的复杂网络.
关键词人类免疫缺陷病毒     男男性行为人群     亚型     传播簇     传播性耐药    
HIV-1 subtype diversity and transmission clusters among men having sex with men who recently got HIV-l infection, in Zhejiang province
Zhang Jiafeng, Yang Jiezhe, Pan Xiaohong , Guo Zhihong, Ding Xiaobei, Xu Yun, Huang Jingjing, Xia Yan    
Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, China
Abstract: Objective To understand the HIV-1 subtype diversity and transmission characteristics in men having sex with men (MSM) in Zhejiang province. Methods A total of 233 newly diagnosed as HIV-1 positive patients in 2011 were screened out by BED capture enzyme immunoassay (BED-CEIA). Among them, 107 eligible subjects were enrolled for further molecular epidemiological study. Viral RNA was extracted from plasma samples and followed by reverse transcription PCR and nested PCR for amplification of pol gene fragments, sequencing, and bioinformatics analysis. Results There were no statistically significant differences regarding the social demographic distribution between the subjects under study and those recently infected MSM population. The rate of success for sequence acquisition was 94.4% (101/107). The highest proportion of subtype was CRF01_AE (62.4%), followed by CRF07_BC (31.7%) and with three cases of subtype B, one case of CRF55_01B and two cases of unique recombinant form (CRF01_AE/B and CRF01_AE/CRF07_BC). The phylogenetic trees were mainly divided into CRF01_AE cluster 1, cluster 2 and CRF07_BC cluster 3. The strains located in Hangzhou were diffused in the branches of phylogenetic tree. 10 transmission clusters were found, in which 80% involved two or more regions and 90% was associated with patients residing in Hangzhou. Three surveillance drug resistance mutations (M46I, T215S and G190A) were found in three samples (each sample harbored only one resistance mutation). The overall rate of transmitted drug resistance (TDR) was 2.97%. Conclusion The increasing complexity of HIV was noticed in MSM in Zhejiang province. However, the prevalence of TDR was low. Cross-regional HIV transmission in MSM was common, which inferred from the study. Hangzhou might play a central regional role in the intra-provincial spread of HIV, to form an interwoven complex network in the MSM population.
Key words: Human immunodeficiency virus     Men who have sex with men     Subtype     Transmission cluster     Transmitted drug resistance    

国内外文献显示,MSM的HIV毒株呈多样性和 复杂性[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]。浙江省MSM的HIV感染维持在较高水 平[8]。本研究对浙江省MSM新近感染者的HIV-1 毒株的遗传多样性进行系统研究,以了解毒株基因 变异情况,并进一步研究传播簇(包括传播性耐药)。 对象与方法

1. 研究对象:2011年浙江省新报告的MSM艾 滋病患者共计837例[8],采用BED捕获酶免试验 (BED-CEIA)检测血清中阳转后HIV-IgG抗体占总 IgG的比例以判断是否为HIV新近感染[9],所用试 剂为美国Sedia生物科学公司的SEDIATM BED HIV-1Incidence EIA试剂盒。排除条件:①已接受 抗病毒治疗;②确证检测后首次CD4+淋巴细胞计 数<200cell/μl;③符合WS293-288《艾滋病和艾滋 病病毒感染诊断标准》中艾滋病病例诊断标准;④既 往诊断为HIV感染的样本。837例新报告的MSM 中的艾滋病患者排除检测251例,6例无确证血清样 本,最终共有580例纳入BED-CEIA检测,233例检 测为新近感染,收集其中的107例(纳为研究对象) 血浆样本进行亚型检测。本研究通过中国疾病预防 控制中心性病艾滋病预防控制中心伦理委员会的伦 理学审查。

2.研究方法:

(1)核酸提取及PCR扩增:研究对象于2011年 CD4+淋巴细胞随访检测时抽取4~8ml EDTA抗 凝全血,采血前均未接受抗病毒治疗,血样立即混 匀,颠倒8~10次,全血标本离心后,分离出血浆和 淋巴细胞富积液分装后于-80℃冻存备用。采用德 国Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini试剂盒从 140μl血浆样本中提取RNA。采用RT-PCR和巢 式PCR方法扩增HIV-1的pol基因蛋白酶(全长)和 反转录酶区(前300个氨基酸位点),扩增产物大小 为1316bp。扩增体系和扩增条件参照文献[10], PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,经DNA Marker比对确认是否含目的片段,目标产物直接送 至北京梓熙生物科技有限公司进行纯化和测序,其 所用测序仪为美国ABI公司PRISM3730XL,测序 试剂为BigDye Terminator3.1Cycle Sequencing试 剂盒。

(2)序列整理及分析:使用Sequencher5.0软件 对测序返回的序列进行清理和拼接,使用BioEdit 7.2.0软件将样本序列和国际参考株序列(来自美国 Los Alamos国家实验室的HIV序列数据库)进行 比对和校正,用Mega6.0软件构建系统进化树(邻 接法),选择Kimura2-parameter模型(BootstraP= 1000),根据系统进化树确定HIV毒株亚型。经整 理合格的基因序列采用美国斯坦福大学HIV耐药数 据库中的Calibrated Population Resistance(CPR)工 具(6.0)分析基因型耐药情况[11](http://cpr.stanford. edu/cpr/servlet/CPR),根据WHO2009版监测性耐药 突变(surveillance drug resistance mutation,SDRM) 位点确定是否存在SDRM突变[12]

(3)重组分析:根据系统进化树分析,未能与已 知的亚型和流行重组型(CRFs)聚类的序列考虑为 独特重组型(URF),采用美国Los Alamos国家实验 室HIV序列数据库的RIP重组分析工具分析重组类 型,然后使用SimPlot3.5.1软件进一步确定重组模 式,分析时设定参数为滑动窗口200bp或350bp, BootstraP=20 bp,GapStrip开 启,重 复100次, Kimura(2-parameter)模 型,T/t:2.0,NeighborJoining。在分析URF时使用HIV序列数据库中的 HIV BLAST工具进行同源性分析,并下载2例高度 同源的新型01B序列(KC183779和KC183780)进行 系统进化树分析[4]。传播簇定义:构建的系统进化 树中分簇的Bootstrap≥90%,簇内样本数≥3个,且 簇内平均基因距离≤0.030。

3. 统计学分析:采用SPSS17.0软件进行χ2检 验。当P<0.05时,组间差异具有统计学意义。 结 果

1. 基本特征:107例研究对象年龄以<35岁为 主(占74.8%),汉族占绝大多数(95.3%),多数未婚 (66.4%),工人、农(渔)民、民工比例最高(41.1%), 初中及以下文化程度比例最高(43.0%)。研究对象 在社会人口学特征方面(年龄、民族、户籍地、现住 址、婚姻、职业和文化程度)与当年检测发现的MSM 新近感染者(233例)差异无统计学意义(表 1)。

表 1 2011年浙江省MSM新近感染者和研究对象的社会人口学特征

2. HIV亚型分析:107例研究对象中101例成功 获得序列,成功率为94.4%(101/107)。基于pol基因 的 系 统 进 化 树 分 析 显 示,63例 为CRF01_AE (62.4%),32例为CRF07_BC(31.7%),3例为B亚型 (3.0%),1例 为CRF55_01B(1.0%),2例 为URF (CRF01_AE/B和CRF01_AE/CRF07_BC各1例, 2.0%)。按社会人口学特征(年龄、民族、户籍地、现 住址、婚姻状况、职业和文化程度)对毒株亚型进行 分组比较,组间差异无统计学意义(均P>0.05)。

经HIV BLAST分析,CD4-4516(CRF01_AE/B) 与安徽省报道的毒株KC183780同源性高达98.7% (1184/1200),据SimPlot软件分析重组模式,其在 pol基因区为CRF01_AE(相对HXB2位置2253→ 3005)和B亚型(相对HXB2位置3006→3452)的重 组(图 1),与KC183780具有极为相似的重组断点模 式。CD4-5002(CRF01_AE/CRF07_BC)经重组分 析 显 示 为CRF01_AE(相 对 于HXB2位 置 2253→3067)和CRF07_BC(相对于HXB2位 置3068→3421)的重组(图 1)。

注:安徽省报道的MSM中CRF01_AE/B毒株KC183780;本研究发现的CRF01_AE/B毒株CD4-4516;本研究发现的CRF01_AE/ CRF07_BC毒株CD4-5002;分析使用的滑动窗口为350bp,分析使用的滑动窗口为200bp,其余分析参数均一致(为默认) 图 1图 1 HIV URF重组断点分析

3.系统进化分析:研究对象所感染的 HIV毒株根据亚型不同,主要分为 CRF01_AE(63例)和CRF07_BC(32例)两大 簇,涵盖94.1%(95/101)的病例。其中 CRF01_AE大簇内部又可分为两簇,簇1(51 例)进一步分化为若干小簇,簇2(12例)进一 步细分为2个亚簇。与CRF01_AE大簇呈明 显差异,CRF07_BC大簇(簇3)内部未见明显 分化(分簇),在进化树上表现为散在集聚。

通过对簇1~簇3的社会人口学特征分 析,整体上未见明显差异,簇2通过检测咨询 发现的比例最高,达75.0%(9/12),在所有研 究对象中检测咨询发现的比例为38.3%(41/ 107),差异有统计学意义(χ2=5.959,P= 0.015)。

从毒株的地域信息(感染者现住址)分析 显示,浙江省的MSM毒株整体上未见明显 的地区聚集性,表现为相互混杂交织,尤其是 现住址为杭州的MSM感染者携带的毒株在 进化树中不只局限于杭州地区,而是散播于 各个进化分支,与全省各地流行的MSM毒 株均有同源性(图 2)。

注:●国际参考株,▲现住址为杭州的病例,◆安徽省报道MSM的01B流行株;加粗的分支(2例)为本研究发现的URF,蓝色椭圆形标示 的为传播簇1~簇10;节点处仅显示≥70%的Bootstrap值 图 2 HIV系统进化树分析

4. 传播簇分析:本研究发现存在10个传 播簇(图 2),共涉及全省7个地(市),报告的 MSM新近感染者占现住址为浙江省的88.3% (189/214);10个传播簇共涉及43例,占所有序列的 42.6%;8个传播簇(80%)涉及≥2个的地市;10个传 播簇中仅传播簇10集中在绍兴地区,其余9个传播 簇(90%)均与现住址为杭州的病例相关(表 2)。

表 2 研究对象的10个HIV传播簇的遗传信息分析

5. 传播性耐药突变与流行水平:根据WHO公 布的监测性耐药突变名录(2009年版),3个样本各 存在1个SDRM突变,分别为M46I(PI SDRM)、 T215S(NRTI SDRM)和G190A(NNRTI SDRM),见 表 3,传播性耐药率为2.97%(<5%),处于HIV耐药 株的低度流行水平。检出存在SDRM的样本感染均 是CRF01_AE毒株,其中2例现住址为杭州市。

表 3 研究对象的HIV罕见亚型、URF和存在SDRM的个案基本信息
讨 论

MSM由于具有性活动活跃、多性伴和肛交性行 为等特征使该人群成为艾滋病流行的高危人群[2, 5], 且在未治疗的MSM感染者中已发生HIV耐药株的传播[1, 5, 13],对艾滋病的预防控制提出严峻的挑战。 本研究显示,浙江省MSM中HIV呈现跨地区网络 传播的特征,毒株亚型呈现复杂性趋势,对未来的艾 滋病防控将产生深远影响;传播性耐药处于低度流 行水平,暂不会对现有抗病毒治疗措施构成威胁。

HIV毒株亚型对于病毒致病性、传播流行、诊 断、治疗和疫苗研发等具有深远影响。中国MSM 的HIV毒株亚型组成随时间经历着显著变化,从 2005年以欧美B亚型为主,到2012年以CRF01_AE 为主[5]。本研究显示,CRF01_AE和CRF07_BC(共 占94.1%)是浙江省MSM中HIV感染者的优势毒 株,与近几年国内其他省份的报道类似[3, 4, 13, 14],也发 现存在一些罕见亚型(如CRF55_01B)和URF。 CRF55_01B于2012年在中国的MSM中首次报 道,并在深圳地区的MSM中出现小的暴发(占 9.2%,99/1072)[15]。本研究发现的CRF55_01B是浙 江省的首例报道,鉴于其近几年在全国的散发流行 趋势,应进一步予以跟踪和监控。MSM具有多性 伴、无保护性行为频繁等特征[2, 5],相比异性传播人 群更易发生HIV双重感染或多重感染[2],因此更易产 生HIV的新型重组型。目前国内MSM的HIV流行 株主要包括CRF01_AE、CRF07_BC和B亚型[7, 14],近 年来又陆续报道MSM存在新型重组型,尤其以 CRF01_AE与B(或CRF07_BC)的新型重组较为常 见[3, 4, 5, 6, 7]。本研究也在MSM各发现1例CRF01_AE/B 和CRF01_AE/CRF07_BC的新型重组,其中感染 CRF01_AE/B新型重组的病例是安徽户籍来浙江 省的打工者,毒株序列与安徽省报道的01B存在高 度同源性[4],该病例很有可能在安徽省发生感染,这 一方面印证MSM存在一定比例的URF,另一方面 也说明形成的URF已形成跨区域的流动,其对艾滋 病疫情的影响值得进一步研究。全国9个城市的 MSM感染者的分子流行病学研究显示,76.7%(447/ 583)的毒株在进化树上分属于3个进化簇(CRF01_AE的簇1和簇2,CRF07_BC的簇3)[5, 14], 其分簇现象与本研究结果一致。

本研究不仅掌握了MSM新近感染者中的HIV 毒株亚型的构成情况,而且能更有效地掌握最新传 播动态。通过系统进化分析和传播簇研究,发现浙 江省MSM新近感染者的特征:存在较多散在流行 圈,各自流行圈正发生着HIV的快速传播;MSM的 HIV传播流行未局限在某一特定区域,跨地区传播 较为普遍,呈现全省甚至更大地域间的传播特征,形 成混杂交织的复杂网络;杭州市作为省会城市,在浙 江省MSM的HIV传播过程中可能发挥着核心作 用,推测是浙江省MSM最重要的活动聚集地,也是 HIV向全省MSM散播的热点地区。中国的MSM 一般怕被认出而不在本地活动,大部分人会集中到 大都市活动,因为那里更易获得社会和性伴网络资 源[3]。本研究显示,带有杭州地域“印记”的毒株散播于全省各地,推测是省内其他地市的MSM汇聚杭 州进行集会活动,感染HIV后又重返原住址造成的 结果。

由于HIV耐药株有可能回复突变成野生株,在 新近感染者中开展传播性耐药监测能更准确地掌 握HIV-1耐药株的流行情况[16, 17, 18]。本研究显示,浙 江省MSM新近感染者的传播性耐药率处于低水平 (<5%),与国内其他地方的报道基本一致[1, 3, 13],与 2009-2011年浙江省整体的低度耐药传播水平一 致[10]。近年来报道国内未治疗的MSM中耐药株呈 增加趋势,耐药突变主要是对我国并未普及使用的抗 蛋白酶药物[1, 13],而本研究显示浙江省MSM PI耐药 突变相对较低(仅1.0%),与云南省报道接近[3]

参考文献
[1] Yang J, Xing H, Niu J, et al. The emergence of HIV-1 primary drug resistance genotypes among treatment-naive men who have sex with men in high-prevalence areas in China [J]. Arch Virol, 2013, 158(4):839-844.
[2] Beyrer C, Baral SD, van Griensven F, et al. Global epidemiology of HIV infection in men who have sex with men [J]. Lancet, 2012, 380(9839):367-377.
[3] Chen M, Ma Y, Su Y, et al. HIV-1 genetic characteristics and transmitted drug resistance among men who have sex with men in Kunming, China [J]. PLoS One, 2014, 9(1):e87033.
[4] Wu J, Meng Z, Xu J, et al. New emerging recombinant HIV-1 strains and close transmission linkage of HIV-1 strains in the Chinese MSM population indicate a new epidemic risk[J]. PLoS One, 2013, 8(1):e54322.
[5] Xu J, Han X, Reilly KH, et al. New features of the HIV epidemic among men who have sex with men in China [J]. Emerg Microbes Infect, 2013, 2(7):e45.
[6] Wang W, Jiang S, Li S, et al. Identification of subtype B, multiple circulating recombinant forms and unique recombinants of HIV type 1 in an MSM cohort in China[J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2008, 24(10):1245-1254.
[7] Wang W, Meng Z, Zhou M, et al. Near full-length sequence analysis of two new HIV type 1 unique (CRF01_AE/B) recombinant forms among men who have sex with men in China [J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2012, 28(4):411-417.
[8] Guo ZH, Xu Y, Xia Y, et al. Estimation of new HIV-1 infection in high risk groups with BED-CEIA in Zhejiang, 2010-2012[J]. Dis Surv, 2013, 28(8):617-620. (in Chinese)郭志宏, 徐云, 夏燕, 等. 应用捕获酶联免疫测定法估算2010-2012年浙江省重点人群人类免疫缺陷病毒1型新发感染率[J]. 疾病监测, 2013, 28(8):617-620.
[9] Parekh BS, Kennedy MS, Dobbs T, et al. Quantitative detection of increasing HIV type 1 antibodies after seroconversion: a simple assay for detecting recent HIV infection and estimating incidence[J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2002, 18(4):295-307.
[10] Zhang JF, Pan XH, Guo ZH, et al. Survey of HIV drug resistance threshold in Zhejiang province from 2009 to 2011[J]. Chin J Prev Med, 2012, 46(6):519-523. (in Chinese)张佳峰, 潘晓红, 郭志宏, 等. 2009-2011年浙江省HIV耐药警戒线调查[J]. 中华预防医学杂志, 2012, 46(6):519-523.
[11] Gifford RJ, Liu TF, Rhee SY, et al. The calibrated population resistance tool: standardized genotypic estimation of transmitted HIV-1 drug resistance[J]. Bioinformatics, 2009, 25(9):1197- 1198.
[12] Bennett DE, Camacho RJ, Otelea D, et al. Drug resistance mutations for surveillance of transmitted HIV-1 drug-resistance: 2009 update[J]. PLoS One, 2009, 4(3):e4724.
[13] Zhao B, Han X, Dai D, et al. New trends of primary drug resistance among HIV type 1-infected men who have sex with men in Liaoning Province, China[J]. AIDS Res Hum Retroviruses, 2011, 27(10):1047-1053.
[14] Han X, An M, Zhang M, et al. Identification of 3 distinct HIV-1 founding strains responsible for expanding epidemic among men who have sex with men in 9 Chinese cities[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2013, 64(1):16-24.
[15] Zhao J, Cai W, Zheng C, et al. Origin and outbreak of HIV-1 CRF55_01B among MSM in Shenzhen, China[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2014, 66(3):e65-67.
[16] Murillo W, Paz-Bailey G, Morales S, et al. Transmitted drug resistance and type of infection in newly diagnosed HIV-1 individuals in Honduras[J]. J Clin Virol, 2010, 49(4):239-244.
[17] Feng LG, Wang MJ, Han M, et al. Drug resistance among recent HIV-l infected men who have sex with men in Chongqing municipality of China[J]. Chin J Epidemiol, 2008, 29(5):455- 458. (in Chinese)冯连贵, 王慜杰, 韩梅, 等. 重庆市男男性接触人群中HIV-1新近感染者耐药监测[J]. 中华流行病学杂志, 2008, 29(5):455-458.
[18] Jayaraman GC, Archibald CP, Kim J, et al. A population-based approach to determine the prevalence of transmitted drug- resistant HIV among recent versus established HIV infections: results from the Canadian HIV strain and drug resistance surveillance program[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2006, 42(1):86-90.