人偏肺病毒（hMPV）引起的儿童急性呼吸道感染可致毛细支气管炎和肺炎等^[1]。研究显示，hMPV是杭州地区儿童急性呼吸道感染的重要病原，已有研究主要检出B1基因亚型^[2]，为进一步了解杭州地区儿童hMPV的流行状况及是否存在其他基因亚型，本研究对该地区儿童呼吸道门诊和住院患儿呼吸道样本进行检测。 对象与方法

1. 研究对象：哨点医院选择杭州地区就诊量大、具有代表性的医院，一家为省级儿童医院，另一家为设有儿科的综合性医院，均为国家流感哨点医院。选取2011年1月至2013年12月<14岁的呼吸道儿科门诊流感样病例（ILI）及住院的严重急性呼吸道感染病例（SARI）为研究对象^{[3, 4]}。收集门诊ILI患儿的咽拭子样本，住院病例收集当日白天新入院诊断为SARI的痰液抽取物（或气管吸取物），并于24 h内送至实验室。样本采集过程均告知患儿家属并征得同意。

2. 研究方法：

（1）hMPV及其他病毒检测：样本病毒RNA提取使用德国Qiagen公司的RNeasy Mini试剂盒，按试剂盒说明书操作。用宝生物工程（大连）有限公司的TaKaRa反转录试剂盒，以随机六聚体引物反转录合成cDNA，-40 ℃保存。采用实时荧光 RT-PCR检测hMPV，检测方法、引物、探针参见文献^[5]，PCR反应20 μl体系中加入1 μl cDNA为模板，使用TaKaRa Ex Taq酶进行扩增。扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环。传统RT-PCR检测hMPV，参考文献^[6]合成hMPV F蛋白基因片段的引物，引物序列：hMPV F-F：5′-GAA AAT CCC AGA CAA TC-3′，hMPV F-R：5′-CCA TGT AAA TTA CGG AGC-3′，扩增条件： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36个循环；72 ℃ 7 min。目的片段526 bp（荧光定量RT-PCR检测荧光信号较强、Ct值较小的样本）。扩增产物测序结果与GenBank已知hMPV F蛋白进行比对。用实时荧光RT-PCR方法检测呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（INF，包括甲型和乙型），方法参见文献^{[7, 8]}。

（2）hMPV基因分型及序列分析：测序由上海生工生物工程有限公司完成。所测序列用NCBI-BLAST和DNAStar软件进行同源性比较。基因分型采用基因测序分型方法，使用Mega 5.0软件，采用邻接法（NJ）构建进化树，参照各亚型标准株序列，毒株亚型以其F基因片段序列在进化树分支中的位置确认。序列比较和进化树分析所用4种不同亚型参考序列均来源NCBI的GenBank注册hMPV病毒株，参考序列号：A1亚型为NL00-1（AF371337）；A2a亚型包括CAN97-83（AY297749）、NL00-17（AY298021）；A2b亚型包括BJ1887（DQ843659）、JPS03-240（AY530095）；B1亚型为NL99-1（AY525842）；B2亚型包括CAN98-75 （AY297748）、BJ1887（DQ843659）。同时将杭州地区hMPV F蛋白核苷酸序列提交GenBank注册。

3. 统计学分析：用SPSS 16.0 软件进行数据整理分析、描述性统计和样本率的χ2检验，组间比较采用χ2分割检验。 结果

1. 一般情况：共纳入2 593例病例，其中儿科门诊1 676例、住院917例。hMPV检出率为6.51%（169/2 593），男性患儿检出率（7.01%，112/1 597）与女性患儿检出率（5.72%，57/996）差异无统计学意义（χ²=1.046，P=0.306）。

2. hMPV检出率：

（1）不同年龄组比较：hMPV检出患儿年龄为1月龄至10岁。以2岁组和3岁组检出率最高，分别为14.14%（28/196）、14.01%（22/157）。卡方分割分析显示，2岁组与3岁组检出率差异无统计学意义（χ2=0.001，P=0.972），与其他各组检出率差异有统计学意义（χ²=38.654，P=0.000）。

（2）不同时间比较：2011年hMPV检出率为6.50%（60/923）、2012年为6.11%（56/916）、2013年为7.02%（53/754），3年检出率差异无统计学意义（χ²=0.570，P=0.752）。hMPV检出有明显的季节性，检出率最高的是2013年3月（21.12%，15/71），各年7－9月检出率较低或未被检出，见图 1。按季节分布，冬季（11.56%）＞春季（9.02%）＞秋季（2.99%）＞夏季（1.74%），见表 1。卡方分割分析显示，夏季与秋季检出率差异无统计学意义（χ2=2.111，P=0.146），冬季与春季检出率差异无统计学意义（χ²=2.378，P=0.123），冬春季与夏秋季差异有统计学意义（χ²=67.032，P=0.000）。

图 1 2011－2013 年杭州地区门诊和住院儿童病例hMPV检出率

图选项

表 1 2011－2013 年杭州地区各季节hMPV检出情况

表选项

（3）门诊与住院病例比较：门诊ILI样本hMPV检出率为6.62%（111/1 676），住院SARI样本hMPV检出率为6.32%（58/917），差异无统计学意义（χ²=0.085，P=0.769）。连续监测显示，住院病例hMPV流行高峰滞后门诊病例1～2个月（图 1）。门诊样本hMPV冬季检出率最高，为13.56%（59/453），其次是春季，为8.08%（35/433）；住院样本春季检出率最高，为9.34%（20/248），其次是冬季，为8.06%（26/243）。门诊与住院冬季两样本检出率差异有统计学意义（χ²=4.669，P=0.031）；春季两样本检出率差异无统计学意义（χ²=1.298，P=0.255）。

3. hMPV基因进化树、序列分析：hMPV检测阳性样本核酸扩增产物测序率为52.07%（88/169）。利用杭州地区88株F基因526 bp基因核苷酸序列构建系统进化树，结果显示，杭州地区hMPV株的遗传谱系分为A、B 两个簇，各簇又分为A1、A2和B1、B2亚簇，其中A1亚簇仅包含1个分支（图 2）。进化树显示，2011－2012年杭州地区以B1基因为优势亚型，2012年底至2013年以A2为主要优势亚型，见图 3。

图 2 2011－2013 年杭州地区hMPV 基因型系统进化树

图选项

图 3 2011－2013年杭州地区hMPV基因型分布

图选项

同源性分析显示，测序的88株阳性基因序列与GenBank参考株序列同源性为81.60%～100.00%。各基因型与代表株核苷酸同源性较高，杭州地区A1基因型仅1例，与代表株NL00-1（AF371337）核苷酸同源性为 99.95%；A2基因型与代表株CAN97-83（AY297749）核苷酸同源性为96.00%～100.00%。B1基因型与代表株NL99-1（AY525843）核苷酸同源性为97.70%～100.00%；B2基因型与代表株CAN98-75（AY297748）核苷酸同源性为94.50%～100.00%。杭州地区的88株hMPV测序结果中12份F蛋白部分基因序列已收录GenBank，登录号为KF729939～KF729950。

4. hMPV不同基因型的年龄分布：A基因<1岁组占优势（53.19%，25/47），其次是1～2岁组（27.65%，13/47）；B基因型1～2岁组最多（46.34%，19/41），其次<1岁组（31.70%，13/41），见表 2 。<1岁和≥1岁A、B基因型检出率差异有统计学意义（χ²=5.143，P=0.023）。

表 2 hMPV不同基因型的年龄分布

表选项

5. hMPV与RSV、INF混合感染情况：2 593份样本的3种病毒混合感染检出率为1.50%（39/2 593），hMPV与RSV或INF感染占23.07%（39/169）。39份混合感染样本中，hMPV与RSV阳性占48.71%（19/39），hMPV与INF阳性占30.76%（12/39），hMPV、RSV、INF同时阳性占5.12%（2/39），RSV与INF混合感染占15.38%（6/39）。 讨论

本研究显示，2011－2013年杭州地区患儿呼吸道感染hMPV检出率为6.51%，其中住院SARI样本检出率为6.32%（58/917），门诊ILI样本检出率为6.62%（111/1 676），门诊ILI与住院SARI样本hMPV检出率差异无统计学意义。与该地区之前的门诊检出率（6.27%）一致^[9]。

本研究还显示，杭州地区患儿<1岁组hMPV检出率最低，1～3岁组较高，4～6岁组检出率逐渐降低，与Daniel等^[10]研究一致。

本研究也显示，杭州地区hMPV每年流行高峰不一致，全年各季节均有hMPV检出，但统计学结果显示，冬春季与夏秋季hMPV检出率差异有统计学意义。杭州冬季检出率为11.56%，与本项目的前期研究（2009－2010、2010－2011冬季）检测结果（11.23%）一致^[2]。杭州住院患儿hMPV高峰在冬末初春，与南京地区报道一致^[11]，可能与所处地域及环境气候有关。

有研究认为，A型hMPV的致病性高于B型^[12]，另报道则认为2种型别的致病性没有差别^[13]。本研究显示，门诊、住院hMPV A基因型阳性样本差异无统计学意义。

hMPV基因型随年代发生不同变化：北京地区2008年7月至2009年3月以hMPV A2最流行，2009年4月至2010年3月以B1为主，其次是B2亚型^[14]。杭州地区在2009－2010年冬季为B1亚型流行^[2]，与上述报道相同，2010－2011年冬季以B1为主。2011－2012年冬季以B1和A2为主，2012－1013年冬季以A2为主。基因进化分型分析，杭州地区hMPV毒株之间的亲缘关系较近，而与同型别内的参考株亲缘关系稍远，如A2b亚型杭州株与同亚型北京株（BJ1887）同属一个基因亚型，在不同的分支，提示杭州地区hMPV有地区特异性。