百日咳是由百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis） 引起，人群普遍易感，尤以婴幼儿多见^[1]。目前90%的病例来自发展中国家^[2]，即便是发达国家或百日咳疫苗接种率很高的国家，其发病率也有上升趋势，即“百日咳再现”^[3]。近年来青少年和成人患百日咳的人数逐渐增多，但其临床症状并不典型，流行病学 特征也有改变，因此有必要开展百日咳监测。本研究对天津市2013年百日咳疑似病例应用Real-time PCR检测百日咳鲍特菌双目标基因，并选择部分阳性标本分析其主要抗原菌毛蛋白基因序列。 对象与方法

1. 研究对象：为2013年1－12月在天津市监测点医院就诊的百日咳疑似病例。就诊病例均由接诊医生按照监测定义进行诊断，同时填写个案调查表开展流行病学调查，并采集鼻咽拭子及静脉血（分离血清），置-20 ℃冰箱保存待检。鼻咽拭子接种于培养皿后置37 ℃生化培养箱中孵育。百日咳疑似病例参照文献^[4]的定义；临床诊断病例按我国卫生部百日咳诊断标准（WS 274-2007）；百日咳疑似病例经PCR检测阳性者，或ELISA检测特异性百日咳毒素IgG（PT-IgG）抗体浓度≥80 IU/ml判定为百日咳确诊病例。

2. 研究方法：

（1）细菌培养及鉴定：鼻咽拭子标本接种于碳血琼脂选择培养基，置37 ℃ 生化培养箱中孵育3～7 d，连续观察。百日咳可疑菌落经涂片染色、触酶及玻片凝集试验鉴定。

（2）百日咳PT-IgG定量检测：按照ELISA试剂盒使用说明书检测血清标本中PT-IgG浓度（IU/ml）。

（3）Real-time PCR检测：采用法国生物梅里埃全自动核酸提取系统提取鼻咽拭子百日咳鲍特菌核酸^[5]。百日咳鲍特菌双目标基因包括重复插入序列481（insertion sequences 481，IS481）基因和1002（IS1002）基因，检测标本中双目标基因扩增循环阈值（Ct）均≤36则判定为阳性。

（4）百日咳FIM 区域基因扩增：FIM2上下游引物序列为5′-ACC CAT GCA AAT CCC TTT CCA ACG C -3′，5′-TCC GGT TCG GAT GAA CCA TGC ATA -3′，目的片段673 bp；FIM3上下游引物序列为5′-TCA GTA TCA GAA TCA CCA TGT -3′，5′-CAG CTG GGG TAG ACG ACG GAA AAG -3′，目的片段638 bp。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环，72 ℃延伸5 min。

（5）测序分析：PCR产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成，根据测序结果应用DNAStar软件进行分析，并与GenBank中相应百日咳鲍特菌基因序列的核苷酸比对。采用GenBank国际标准株 Tohama I（BX640415.1） 、中国百日咳疫苗CS株（CP002695）、18323株（HE965805.1）进行序列比较和分析，其他百日咳鲍特菌FIM2、FIM3基因序列对应登录号分别为Y00527.1和X51543.1。

3. 统计学分析：采用Excel 2003软件建立数据库，SPSS 13.0软件进行统计分析，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果

1. 病例概况：2013年共检出181例百日咳疑似病例，其中采集到鼻咽拭子标本148例，血清标本108例；经临床诊断和实验室确诊百日咳病例共169例，其中男性92例，女性77例，性别比1.19 ∶ 1；病例年龄最小为出生后15 d，最大64岁；以婴儿和成人两年龄段高发，＜1岁组75例（44.37%），其中＜3月龄30例（17.75%），3～5月龄27例（15.97%），6～12月龄18例（10.85%）；1～6岁21例（12.42%），7～14岁12例（7.1%），≥15岁61例（36.09%）。全市16个区县均有病例报告，病例数居前3位的区县为静海（70例）、津南（13例）、西青（11例），宁河县仅1例；各月均有病例报告，但以夏季高发，6－8月发病84例（49.7%），其中7月最多45例（26.62%）。101例核酸检测阳性病例其病程为3～56（M＝11）d；60例PT-IgG抗体阳性病例的病程为12～78（M＝21）d。

2. Real-time PCR检测：148份鼻咽拭子标本采用Real-time PCR检出阳性101份，阳性率为68.24%；108份血清标本中ELISA检出阳性60份，阳性率为55.56%。两种检测方法比较，差异有统计学意义（χ2＝4.809，P＝0.028）。在Real-time PCR检出阳性的101份标本中，28份采用两种方法检测均阳性，23份为Real-time PCR阳性、PT-IgG阴性；ELISA检出阳性的60份标本中有13份PT-IgG阳性、Real-time PCR阴性。43份鼻咽拭子进行细菌培养，鉴定出百日咳鲍特菌5份（阳性率11.62%），后经Real-time PCR检测均为阳性。经Real-time PCR检测阳性的101例中＜1岁年龄组59例，阳性率为84.28%，与其他年龄组比较差异有统计学意义（χ2＝43.128，P＜0.001 ），见表 1。

表 1 2013年天津市148例不同年龄组百日咳病例 Real-time PCR检测结果

表选项

3. 百日咳鲍特菌FIM 基因扩增及序列分析：从101份核酸阳性标本中随机选择30份，应用PCR扩增百日咳鲍特菌FIM2和FIM3基因，扩增产物经过1.2%琼脂糖电泳分析，分别可见673 bp、638 bp 的特异性条带，其大小与理论值一致（图 1）。

图 1 PCR扩增百日咳FIM2基因 DNA电泳图

图选项

FIM2基因开放阅读框（ORF）从181位碱基到801位碱基，编码一个207个氨基酸的蛋白。对30 份核酸阳性标本百日咳FIM2基因中673 个 核苷酸（177～849）进行扩增，包括整个ORF。序列比对分析结果显示30株百日咳鲍特菌FIM2基因（673 bp）核苷酸序列同源性在99.6%～100.0%，与GenBank中登录的相应百日咳国际标准株 Tohama I（BX640415.1）、中国百日咳疫苗CS株（CP002695.1）、疫苗株18323 （HE965805.1）和 FIM2（Y00527）的FIM2基因进行序列同源性比对，结果显示核苷酸序列同源性均为 99%，在811、813、839、842位置碱基发生A-G、A-T、T-C、G-A的无义突变，突变位置在ORF外。FIM2基因ORF核苷酸序列推导的氨基酸序列未发生变异。

FIM3基因ORF从336位碱基到947位碱基，编码一个204个氨基酸的蛋白。对30份核酸阳性标本百日咳FIM3基因中638个核苷酸（318～955）进行扩增，包括整个ORF。序列比对分析结果显示30株百日咳鲍特菌FIM3基因（638 bp）核苷酸序列同源性在99.8%～100.0%，与GenBank中登录的相应百日咳国际标准株 Tohama I（BX640415.1）、中国的百日咳疫苗CS株（CP002695.1）、疫苗株18323 （HE965805.1）和 FIM3（X51543）的FIM3基因进行序列同源性比对，结果显示核苷酸序列同源性均为 99%，在328、329位置碱基发生G-A、A-G的无义突变，突变位置在ORF外。FIM3基因ORF核苷酸序列推导的氨基酸序列未发生变异。分析结果显示天津地区流行的百日咳鲍特菌与国际标准株 Tohama及CS菌株、18323菌株亲缘关系较近。 讨论

诊断百日咳感染的实验室方法主要包括细菌培养、免疫学和分子生物学的检测，基于细菌培养作为金标准。经典的细菌培养法虽然具有较好的特异性，但菌培养影响结果因素较多，且培养一般需要3～7 d 才能出结果，不利于快速诊断和治疗。由于PCR准确快速对病原学诊断已成为WHO和美国疾病预防控制中心进行百日咳实验室确诊标准之一，现在国际上荧光定量PCR 成为发展方向^{[6, 7]}。由于感染人类呼吸道的不同鲍特菌属间存在遗传基因的高度相似性，如霍氏百日咳鲍特菌和支气管（败血）百日咳鲍特菌，并能引发百日咳样症状，故单独使用IS481作为目标基因检测百日咳鲍特菌的方法，特异性难以保证^{[8, 9]}。由于IS1002是百日咳鲍特菌除IS481以外的另一段特异性重复插入序列，且霍氏百日咳鲍特菌和支气管（败血）百日咳鲍特菌尚未发现IS1002序列，因此选择IS481和IS1002双目标基因方法避免单一基因检测可能出现的假阳性。

本研究分析了2013年天津地区百日咳疑似病例百日咳鲍特菌分子流行病学监测结果，PCR检测阳性率高于PT-IgG阳性率，检测病程M＝11 d，比 PT-IgG检测的病程M＝21 d缩短近一半时间，表明该方法更利于百日咳早期诊断。本研究结果显示＜1岁病例PCR检测阳性率显著高于其他年龄段，其原因可能是婴幼儿百日咳病例症状典型，就诊及时，在发病早期就能采集到检测标本。成人百日咳病例因症状不典型、易漏诊误诊，发现并采集标本是已到患病后期，因此检测阳性率低，同时作为重要传染源，易造成未接种或未完全接种疫苗的婴幼儿百日咳感染。

百日咳鲍特菌FIM2和 FIM3为百日咳疫苗生产用菌株主要抗原片段，是重要抗原成分^[10]。本研究对天津地区临床上分离的百日咳流行株FIM2和 FIM3重要抗原成分进行同源性比较，结果显示目前流行株的同源性高，与国际标准株 Tohama I、中国的百日咳疫苗CS株、疫苗株18323亲缘关系较近，说明我国百日咳疫苗对目前流行的百日咳菌免疫仍然有效。近年接种过百日咳疫苗的青少年和成人患百日咳的病例逐渐增多，甚至局部地区发生暴发。近来在百日咳疫苗覆盖率较高的国家，每间隔3～5 年发生百日咳流行高峰，传播模式从过去的“儿童-儿童”转变为现今的“青少年-成人-婴幼儿”。应建立健全实验室诊断及监测技术，早期及时诊治，切断传播途径，预防和控制百日咳感染。