肠道病毒（EV）71型和柯萨奇病毒（Cox）A16型是导致手足口病的主要病毒，也有部分非EV71和非Cox A16型病毒导致手足口病，针对这部分病毒的研究较少。本研究对泰州市各监测哨点医院诊断为手足口病患儿的1 509份临床咽拭子和肛拭子混合标本进行研究。 1. 材料与方法: 　　

（1）标本采集与核酸检测： 2010年6月至2013年12月在泰州市各监测哨点医院采集诊断为手足口病患儿的1 509份临床咽拭子和肛拭子混合标本。标本经振荡混匀后吸取150 μl采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral mini试剂盒提取核酸，然后采用江苏默乐生物科技公司三重荧光PCR试剂盒检测EV71、Cox A16和EV共有位点，结果按说明书进行判断。用自行设计的引物对EV共有位点阳性、EV71和Cox A16阴性者的EV进行VP1序列扩增并测序。 　　

（2）EV VP1序列及血清型分析：VP1序列通过BLAST方法搜索GenBank同源性最大的EV VP1序列，从而确定所属血清型。统计未分型EV各血清型构成比，选取主要血清型进行构成比时间趋势分析，并计算相应的χ2检验和皮尔逊线性相关系数^[1]。 　　

（3）Cox A6 VP1基因特征：从GenBank中下载其他地区Cox A6 VP1基因全序列，与本研究所测序列合并为1个数据集。用MrBayes软件构建进化树，并用BLAST软件对进化树中的重点分支进行分化时间、有效种群规模以及毒株传播路径进行推算。用PAML软件包中的Codeml程序对VP1基因氨基酸位点的变异进行选择压力分析。 2. 结果： 　　

（1）血清型构成：共检出非EV71和非Cox A16 EV 283株，占所有阳性EV总数的24.91%，包括12种血清型，分别是194株Cox A6、 61株Cox A10、 10株Cox A12、 6株Cox A4、 3株Cox A14、2株Echo 3以及Cox A5、Cox A2、Cox A24、Echo 9、Echo 19和Cox B3各1株。Cox A6是其中最主要的血清型，在泰州市随时间的流行趋势与总体未分型EV相应趋势高度一致（图 1），两者的皮尔逊相关系数为0.993 7。Cox A6在2010－2013年的其他时段处于散发态势，2012年第四季度至2013年第四季度出现1个流行高峰，顶峰在2013年第二季度，而处于该流行峰期间的Cox A6的数量显著高于其他时段，相应的统计量为χ2＝170.179 1，自由度为1的显著性P＜0.01。

图 1 Cox A6和Cox A10构成比按季度变化趋势

图选项

（2）Cox A6基因特征：选取符合要求的403株Cox A6 VP1序列构建基因进化树，上述流行高峰期所采集的Cox A6共计114株，其中84株聚集成1个单独分支（CladeTZ2013），该分支与2012－2013年上海地区及2009－2011年台湾地区部分流行株高度同源，聚合成一个更大的分支（命名为Clade 1）。CladeTZ2013分支内部有1个52株泰州市流行株聚集成的较大分支（Clade 2），分支内的所有毒株在VP1基因氨基酸序列254位点均发生R→K突变。对上述3个分支内的种群规模扩张趋势分析均推测出3个较为一致的种群扩张高峰，即在2012年12月种群规模开始扩张，到2013年5－6月到达顶峰。对254位点所发生变异的自然选择作用分析，结果显示，在分支位点模型的假设下该位点ω（ω＝dN/dS）＞1的经验贝叶斯后验概率为99.8%，而与相应的无效模型的似然比χ2检验的P＜0.01，故推测该位点的变异是正向选择作用的。Clade 1中Cox A6的传播进程分析显示，在2012年7月起源于常熟地区附近的CoxA6变异株传入泰州市。经过约5个月的传播与扩散，于2012年12月底在泰州市高港区附近分化出VP1基因氨基酸序列254位点发生了R→K突变的变异株，随后以该地点为扩散中心，Cox A6在泰州市加速扩散，至2013年12月传播格局已基本形成。 3. 讨论：

泰州市2010－2013年的手足口病EV的血清型谱除EV71和Cox A16外，以Cox A6为主，该结果与已有研究结果类似^{[2, 3, 4]}。Clade 1、CladeTZ2013和Clade 2进化分支均推测出1个几乎一致的种群扩张峰； Clade 2为前2个分支的共有子集，推断该扩张峰是由Clade 2内的种群扩张引起的，而Clade 2 正是由VP1基因氨基酸254位点发生R→K的突变的52株变异株所形成的分支，故进一步推测254位点的变异与所推测出的这轮有效种群规模的扩张有关联。同时，Cox A6传播路径分析也显示VP1氨基酸254位点发生R→K突变（形成Clade 2）后，加快其传播速度。Cox A6在泰州市实际出现的流行高峰起峰时间以及达顶峰的时间与推测出有效种群规模扩张高峰完全吻合，故泰州市Cox A6的流行高峰与VP1氨基酸254位点发生R→K突变有关联。