流行性乙型脑炎（乙脑）病毒（JEV）可引起人类急性中枢神经系统疾病。为掌握浙江省媒介蚊虫中JEV的基因型别和人群JEV抗体水平，于2012－2013年对仙居县乙脑监测点的蚊虫样本和健康人群血清开展病原学和血清学研究。 材料与方法 　　

1.标本来源：2012－2013年6－8月在浙江省仙居县乙脑监测点（官路镇北岙村和白塔镇东安村）采集猪、牛圈和人房中蚊虫，于20：00悬挂紫外诱蚊灯，次日04：00－05：00将诱蚊灯取回，在实验室内室温饲养，待蚊血消化后，用电动吸蚊器收集蚊虫。标本采集后于-20 ℃冰箱放置10 min，剔除雄蚊，对雌蚊进行分类，分别装入冻存管，每管40～50只为1批，标本用干冰运输到省级乙脑实验室，-80 ℃低温冰箱保存。2012年和2013年分别采集蚊虫6 110只和5 540只，其中三带喙库蚊分别为4 290只（70.2%）和2 289只（41.3%）。采用随机抽样方法在监测点选择5个不同年龄组健康人群，分别于2012－2013年乙脑流行前的5月和流行后的11月采集同一人血液标本，同时现场进行一般资料、免疫接种史、牲畜饲养等流行病学调查，共调查642人，采集血液标本1 263份，其中2012年279人，采集样本555份，2013年363人，采集样本708份。样本分离血清后，送省级乙脑实验室。 　　

2.病毒分离及鉴定：从-80 ℃冰箱中取出蚊虫冻存管，将蚊虫标本迅速倒入研磨器中，加入Hanks液l.5 ml清洗，吸出液体后加入l.5 ml 研磨液（不含牛血清的维持液）反复研磨至组织碎片基本消失为止。将研磨液吸入离心管，4 ℃ 12 000 r/min，离心30 min。吸取上清液用于病毒分离。参见文献^[1]采用 C6/36和BHK-21细胞（来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所脑炎室）进行病毒分离，阳性分离物采用JEV荧光RT-PCR方法进行验证^[2]。 　　

3.病毒E基因序列分析：采用德国Qiagen公司 Rneasy mini试剂盒提取核酸。E基因扩增采用RT-PCR法，引物及方法参见文献^[3]。PCR产物纯化后由生工生物工程（上海）有限公司进行测序。数据处理和序列比对采用DNAman和ClustalX软件，进化树构建采用Mega软件，建树方法采用邻接法，可信度评估采用1 000 bootstrap值。 　　

4.中和抗体测定：采用微量细胞中和试验法。将待检血清56 ℃灭活30 min，从1 ∶ 10开始稀释，2倍系列稀释至1 ∶ 320，加等量病毒悬液（100 TCID50），置37 ℃ 5%CO2培养箱中和1.5 h，将血清和病毒混合液加入到已长成单层的BHK-21细胞上，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，7 d判断结果。抗体几何平均滴度（GMT）≥1 ∶ 10判定为阳性。JEV株为本实验室从2012年仙居乙脑监测点蚊虫样本中分离获得（ZJ12-3株），病毒滴度为105.8TCID50/ml。 　　

5.统计学分析：采用Excel 2003软件进行统计学分析。 结 果 　　

1.一般情况：采集三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、淡色库蚊（Cx. pipiens pallens）、中华按蚊（Anopheles sinensis）和骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）3属4种共11 650只蚊虫标本，其中以三带喙库蚊最多，占采集蚊虫总数的56.5%（表 1）。

表 1 2012－2013年仙居县监测点蚊虫采集数量及病毒分离

表选项

2.病毒分离：将蚊虫标本分为152批进行研磨处理，所有上清液在BHK-21和C6/36细胞上连续盲传3代，共获得25株病毒分离物（21株分离于三带喙库蚊、2株分离于淡色库蚊、2株分离于中华按蚊），在连续传代过程中，均能够引起C6/36和BHK-21细胞产生稳定的细胞病变。25株病毒经JEV荧光RT-PCR法检测，病毒核酸均为阳性（表 1）。 　　

3.E基因同源性分析：从25株JEV中选取13株扩增病毒E基因，并进行核苷酸（nt）序列测定，所有测序毒株E基因全长1 500个nt，推导编码500个氨基酸（aa）。浙江省新分离JEV与浙江省2007－2010年JEV之间nt和aa同源性分别为98.6%～99.3%和99.2%～99.8%，与浙江省1982－1983年JEV之间nt和aa同源性分别为87.8%～88.3%和98.4%～99.0%，与疫苗株SA14-14-2之间nt和aa同源性分别为87.7%～88.0%和96.4%～97.2%。 　　

4.E蛋白毒力位点分析：浙江省2012－2013年JEV与强毒株（P3、Beijing-1）相比，8个E蛋白相关毒力决定关键位点（E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439）均未发生改变（表 2），浙江省2012－2013年JEV与浙江省2007－2010年JEV在E蛋白区14个主要aa位点均相同，与浙江省1982－1983年JEV比较存在4个共同位点差异（E129、E222、E327、E366），与疫苗株SAl4- 14-2比较存在14个共同位点差异。

表 2浙江省JEV E蛋白主要位点aa差异比较

表选项

5.系统进化分析：选择不同分离年代、分离国家、宿主来源、基因型别的60株JEV E基因进行系统进化分析（图 1），结果显示，全球JEV分为5个基因型，2012－2013年浙江省JEV均属于基因Ⅰ型（GⅠ），与浙江省2007－2010年JEV、SH03-124株和TPC0806c株位于同一个进化分支上，亲缘关系很近，浙江省1982－1983年JEV则位于基因Ⅲ型（GⅢ）进化分支上。

图 1 浙江省JEV在E基因区进化分析

图选项

6.人群JEV中和抗体水平：2012年共调查5个年龄组279人，采集乙脑流行前后标本分别为279份和276份，JEV中和抗体阳性分别为93份和87份，阳性率分别为33.3%和31.5%（χ2＝0.68，P＞0.05），GMT分别为1 ∶ 2.56和1 ∶ 2.68（u＝0.64，P＞0.5）；2013年共调查363人，采集流行前后标本分别为363份和345份，抗体阳性分别为152份和145份，阳性率分别为41.9%和42.0%（χ2＝1.76，P＞0.05），GMT分别为1 ∶ 3.74和1 ∶ 3.53（u＝0.49，P＞0.5），2012年和2013年流行前后乙脑抗体阳性率和GMT差异均无统计学意义（表 3）。

表 3 浙江省仙居县健康人群流行前后乙脑中和抗体水平

表选项

2012－2013年在仙居县采集的1万余只蚊虫标本中从三带喙库蚊、淡色库蚊和中华按蚊中共分离到25株JEV，其中三带喙库蚊中分离到21株，提示三带喙库蚊是该地区传播乙脑的主要媒介蚊种。 　　

E基因同源性分析显示，浙江省2012－2013年JEV与浙江省2007－2010年JEV比较，E基因区nt和aa的差异分别为≤1.4%和≤0.8%，与浙江省1982－1983年JEV比较，nt和aa的差异分别为≤12.3%和≤1.6%，提示浙江省JEV分离株虽然前后时间跨度30余年，但在外环境中循环的JEV变异较小。 　　

对比研究JEV疫苗株与野毒株的毒力显示，E蛋白中有一些关键位点是影响JEV毒力的关键位点^[4]，特别是E138，如果由谷氨酸（Glu）变为赖氨酸（Lys），则可能影响病毒复制周期，进而引起病毒的毒性降低^[5]。在E蛋白500个aa序列中，浙江省2012－2013年JEV与浙江省2007－2010年JEV比较在14个共同位点完全一致，与疫苗株SA-14-14-2比较存在14个共同位点差异，而与JEV强毒株（P3、Beijing-1）比较，在8个重要aa位点完全相同，尤其是E138位点均为Glu，毒力并未降低，提示浙江省JEV分离株均具有野毒株的特征。在JEV E蛋白的三个活性结构域内，中和位点主要集中在结构域Ⅲ的E337-345、E377-382、E397-403 三个区域内^[4]，其变异会导致抗原性的改变^[6]，浙江省JEV在该区域与疫苗株SA14-14-2完全一致。通过对浙江省JEV的E区段aa序列分析，推测现在使用的乙脑疫苗株在理论上可以覆盖浙江乙脑流行株。 　　

采用E基因全长1 500 nt进行基因分型，将全球JEV分为5个基因型（Ⅰ～Ⅴ），我国存在Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ基因型，目前主要流行株为Ⅰ型。浙江省2012－2013年JEV属于Ⅰ型，与浙江省2007－2010年JEV基因型相同，而浙江省1982－1983年JEV属于Ⅲ型，前后相差30年左右，浙江省JEV由Ⅲ型转变为Ⅰ型。近年来，中国及亚洲的其他国家如日本、越南和泰国也发生了类似JEV基因型别的更替^{[7, 8, 9, 10]}，基因Ⅰ型JEV已成为亚洲地区的最主要基因型别^[11]，浙江省的情况与国内外类似。JEV只有1个血清型，推测由基因Ⅲ型JEV制备的乙脑疫苗，无论是灭活疫苗（P3株）还是减毒活疫苗（SA14-14-2株），能够保护各个型别的JEV，但保护效果会有一定差异。通过病毒基因组序列分析以及使用活病毒进行生物学实验也初步验证了该观点^{[12, 13]}，但是仍需进一步深入开展乙脑疫苗对不同型JEV保护率的研究。 　　

健康人群免疫水平是评价人群对JEV免疫状况的重要指标，开展健康人群乙脑抗体水平监测，掌握人群免疫状况，可以了解当地人群乙脑免疫水平特征。仙居县2012－2013年健康人群乙脑抗体阳性率为31.5%～42.0%，比陕西省铜川市乙脑低流行区人群抗体阳性率（24.07%～27.31%）高^[14]，低于河南省洛阳市人群抗体阳性率（46.53%～46.88%）^[15]。经过一个乙脑流行季节后，流行前后人群乙脑抗体阳性率没有明显变化，GMT无明显上升，与陕西省安康和铜川地区监测的乙脑流行前后人群抗体阳性率无明显变化相似^[14]。抗体阳性率最高的年龄组均为＞60岁人群，该年龄组人群未接种过乙脑疫苗，这可能与浙江省20世纪60年代和70年代初曾发生乙脑大流行（1966－1967年乙脑发病率为46.4/10万～47.5/10万），该年龄段人群在乙脑大流行期间由于自然感染和隐性感染，获得了比较稳固的乙脑免疫力有关，与陕西省和云南省曲靖市调查的在＞60岁组没有乙脑疫苗免疫史的人群中但抗体阳性率仍有97.5%和90.05%的结果相一致^[14]，提示自然感染是影响人群乙脑抗体水平的重要因素。仙居县虽然大年龄组人群（60岁组）抗体阳性率很高（＞88.6%），但＜7岁年龄组人群抗体阳性率比较低（≤19.4%），为乙脑易感人群，因此，在乙脑传播媒介广泛存在的情况下，做好乙脑疫苗基础免疫和加强免疫工作，对提高人群乙脑免疫力降低乙脑发病率至关重要。 　　

（仙居县疾病预防控制中心完成样本采集工作，特此志谢）