虽然高效抗反转录病毒治疗（HAART）在HIV 抗病毒临床治疗上取得很好的效果，然而HIV-1基 因耐药突变也在不断增加。有研究表明即使在很高 的病毒载量水平下（≥10⁴ copies/ml），传统HIV基因 型耐药检测技术（Sanger测序）无法检测到较低水平 的耐药突变（＜20%）^{[1, 2]}。新开发的“超深度焦磷酸 测序（UDS）”能够一次性获得更高通量的HIV基因 组测序结果，可以帮助了解病毒株中那些罕见、低频 的耐药突变位点。目前我国将UDS用于HIV耐药 检测的研究和文献少见。为掌握和灵活运用此技 术，2013年同时采用UDS和Sanger测序对90份未 接受抗病毒治疗的HIV感染者进行HIV基因型耐药 研究，并分析湖南省未治疗的HIV感染者中原发性 耐药流行趋势。 材料与方法

1. 样品来源：本实验室保存的2011年7月至 2012年6月来自衡阳市和长沙市未接受抗病毒治疗 的HIV感染者血浆90份，其中长沙20份，衡阳70 份。所有样本病毒载量均≥10⁴ copies/ml。

2. 实验室检测：①HIV载量检测：用“COBAS TaqMan HIV-1test”全自动病毒载量检测系统（美 国罗氏公司），检测病毒载量。②UDS：cDNA合成 用罗氏公司提供的HIV试剂盒（内部研发，暂未上 市），每个样本对应HIV pol区[包括蛋白酶区和反转 录（RT）区]的4条特异引物，共1.3kb，每条特异性 引物上连接着多重标记物（MID）。扩增子使用 Agencourt AMPure XP magnetic beads试剂（美国贝 克 曼 库 尔 特 公 司）进 行 纯 化，使 用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（美国Invitrogen公司） 进行荧光定量分析确定核酸含量。若核酸含量低于 5ng/μl，使用Agilent2100bioanalyzer （Agilent Life Science，Santa Clara， California，US）对扩增产物长度和 质量进行分析，确定是否弃掉该扩 增产物。所有样本的4个扩增产物 等mol集合合成为1管，然后进行油 包水PCR。油包水PCR产后，将 500000个被富集的DNA beads被均 匀的铺到1个PTP芯片上，放到GS Junior上进行焦磷酸测序（正向与反 向同时测序）。数据分析采用罗氏 公 司 的Variant Analyzer（AVA）软 件。所有与HIV抗病毒治疗耐药性 相关的氨基酸位点的判断和分析均来自斯坦福大学 HIV耐药突变数据库（http：//hivdb.Stanford.edu）^[3]。 ③Sanger测序：用QIAamp Viral RNA Mini Kit试 剂盒（德国Qiagen公司）提取RNA为模板，采用巢 式PCR扩增HIV-1pol基因区，扩增产物长度约 为1160bp，包括蛋白酶区以及RT区，第1轮PCR使 用宝生物工程（大连）有限公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，第2轮PCR以第1轮 扩增产物为模板，使用天根生化科技（北京）有限公 司的Perfectshot TM Ex Taq Mix试剂盒，反应条件参 考相关文件^{[1, 2, 3, 4]}。两轮PCR扩增引物见表 1。将扩 增产物送交北京诺赛基因研究中心有限公司进行 序列测定，测序引物见表 1。测得的序列应用 Contig Express和BioEdit软件拼接整理和校对，并 提交斯坦福大学的HIV序列网络数据库进行数据 分析和讨论。

表 1 基因型耐药性检测使用的引物

表选项

3. 统计学分析：统计学分析采用SPSS13.0软 件。P＜0.05为差异有统计学意义。 结 果

1. 样品亚型：检测发现75个样本为CRF01_AE 亚型（83.3%，75/90），9个为B亚型（10.0%，9/90），5个 为C亚型（5.6%，5/90），1个是G亚型（1.0%，1/90）。

2. UDS：90例样本UDS全部成功测序。72.2% （65/90）的 样 本 产 生 了 传 播 性 耐 药 突 变 位 点 （TDRs），其中突变频率＞1%的RT基因区耐药突变 位点样本有38例（突变频率范围：1.02%~75.36%）。 见表 2。对核苷类反转录酶（NRTI）耐药突变者14 例（15.6%，14/90），对非核苷类反转录酶（NNRTI）耐 药突变者15例（16.7%，15/90），同时对NRTI和 NNRTI类耐药突变者9例。共发现在16个位置上发生54频次的耐药突变。其中，针对NRTI类药物 的突变位点：K65R为8例（8.89%，8/90），D67N/G为 7例（7.78%，7/90），T69N为4例（4.44%，4/90）， M184I为2例（2.22%，2/90），T215I/S为2例（2.22%， 2/90），M41L、L74V、F77L以及K219Q等突变位点 均只发现了1例；针对NNRTI类药物的突变位 点：V179D/E/I15例（16.67%，15/90），Y188C/H4例 （4.44%，4/90），P225H3例（3.33%，3/90），G190E/A 2例（2.22%，2/90），而K101E和V106A均只发现了 1例（1.11%，1/90）。17例样本（18.89%，17/90）有针 对RT基因区的中度及以上的耐药突变。

表 2 UDS测序检测耐药突变位点情况

表选项

3. Sanger测序：采用Sanger测序90份样本成功 测序89例（98.9%，89/90）。RT基因区产生耐药突变 的共有7例，其中针对NRTI耐药突变的有6例， NNRTI耐药突变位点的有5例，见表 3。

4. UDS与Sanger测序的比较： UDS检测出了38例样本在16个氨基 酸位置产生了针对RT基因区的54个 频次的耐药突变。Sanger法检出7例 在4个氨基酸位置产生了11个频次的 耐药突变。Sanger法检出突变频次为 UDS检出频次的20.37%（11/54）。

表 3 Sanger测序检测HIV耐药突变位点情况

表选项

本研究显示，湖南省衡阳市和长 沙 市 人 群 感 染 的HIV分 为CRF_ 01AE、B、C和G亚型，CRF_01AE在 不同感染途径的比率明显高于其他亚 型（83.33%，75/90），为当前优势毒株， 与湖南省近4年监测结果吻合^{[4, 5, 6, 7]}。与 江西、广东、福建、广西等地类似，而不 同于我国北方省份，可能与湖南地处 华南，人群主要往来南方省份和东南 亚有关^[6]。过去分离到的A、D亚型没 有再发现^[8]，可能这两种亚型传播人 数较少。

本研究还显示，主要原发性耐药 位点分别是：M41L，D67G/N，M184I， K65N/R，T215I/S，P225H，Y188C/H， K101E，V106A，T215I/S和G190A/E， 这些RT区耐药位点在2009年已经发 现^[7]，为湖南省常见耐药突变位点。 相关文献报道^{[9, 10, 11]}，M41L突变常与 215位 置 一 起 产 生，从 而 导 致 对 Zidovudine（AZT）和stavudine（d4T）产生中度以上 耐药，对tenofovir （TDF）产生低度耐药；K65N/R和 T215S/I常引起d4T低度耐药以及lamivudine （3TC） 和TDF中度耐药；M184V引起对3TC高度耐药，但 是同时也增加了针对AZT、TDF、d4T的药物敏感性。D67G/N常与70或215一起发生，导致NRTI中 3TC以外的其他药物不同程度耐药；K101E与 Y188C/H会引起nevirapine（NVP）的中度或高度耐 药以及efavirenz（EFV）低度耐药；V106A和G190A/E 导致NVP和EFV高度耐药，P225H与K103N一起 出现时会增加对EFV的耐药。湖南省初始一线抗 病毒治疗方案是由d4T，3TC，NVP，EFV，TDF，AZT 以及lopinavir/ritonovir （LPV/r）组成的三联疗法。暂 未发现引起LPV/r耐药的突变位点，这与LPV/r目前 是二线治疗方案还未普及使用有关。而在1例样本 发现了L74V，它可引发ddI和ABC耐药，ddI和ABC 并未在湖南省使用，可能是输入引起的。

本研究也显示，在UDS方法检出的54个耐药位 点中，8个为高频（≥20%）耐药突变，有6个被传统 测序同时检出，提示对高频耐药突变（≥20%）这两 种测序方法区别不大。但对于低频耐药突变（＜ 20%），UDS检出46个突变位点，而传统方法仅检出 5个，UDS敏感性远高于Sanger测序。UDS检测到 所有的耐药突变位点中超过85%以上为低频耐药突 变（＜20%），其中绝大多数都没有被传统基因型耐 药检测方法检测到（P＜0.01）。依靠传统测序方法 检测，近4年湖南省未治疗HIV感染者中原发性耐 药每年均低水平传播（＜5%）。然而本研究数据显 示，采用UDS发现有18.9%（17/90）的样本产生了针 对RT中度或高度的耐药，提示通过Sanger法测序能 够鉴定出显著的耐药性突变（≥20%），但对于尚未 达到显著突变量的突变位点或稀有型抗药型突变 （＜20%）不能及时发现。UDS则能更灵敏检测到低 频突变毒株^{[2, 12, 13, 14, 15, 16]}。

当前高病毒载量伴低水平的耐药突变（1%左 右）难以被传统的检测手段所发现，有可能在药物选 择的压力下增加抗病毒治疗的失败^{[17, 18, 19, 20, 21]}。因此选择 更高灵敏度和精确度的技术检测低水平耐药突变位 点，对于预警和研究原发性耐药毒株的流行和传播 及HIV抗病毒临床治疗有着十分重要的意义。