致泻性大肠埃希菌（DEC）是引起腹泻的主要病原体。根据其致病机制可分为肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）和肠出血性大肠埃希菌（EHEC）。不同型别的DEC 具有特异性的毒力因子^{[1, 2]}。目前临床诊断的腹泻病例较少进行病原学检测，尤其是针对DEC腹泻，如采用传统的血清学鉴定则可造成大量漏诊。近年国内外多通过毒力基因检测，对DEC进行致病型分析，该方法简便快速、节约成本，并可判断菌株是否存在致病能力，具有公共卫生意义。为此本研究收集2012－2013年北京地区腹泻患者粪便标本，进行DEC分子水平监测，以掌握本地区内DEC的感染类型和流行病学特征。 材料与方法

1. 标本来源：2012年1月至2013年12月收集北京地区6个区县17家医院肠道门诊腹泻病例，按照“北京市肠道传染病监测方案”的要求进行规范采样，共收集6 370份标本。所有待检标本保存Cary- Blair运送培养基，于24 h 内送至各区县疾病预防控制中心（CDC）进行菌株分离培养鉴定及毒力基因检测。

2. 方法： （1）分离培养鉴定及血清分型：粪便标本接种MAC平板，（36±1）℃培养过夜；挑取5个可疑DEC菌落（粉红色、凸起、光滑、湿润），进行三糖铁和MIU初步生化试验鉴定及VITEK全自动系统生化分析。所需生化培养基和生化试剂均购自北京陆桥技术有限公司。5种DEC血清分型采用宁波天润生物药业有限公司诊断血清。所有操作按试剂盒说明书进行，用生理盐水作为对照。 （2）荧光PCR检测毒力基因：对系统生化鉴定阳性菌株，转种LB平板后，可直接刮取菌苔，加入200 μl无菌蒸馏水，振荡分散细菌后，100 ℃水浴10 min，10 000 r/min离心10 min，吸取上清用于PCR模板。荧光PCR反应：①反应体系：25 μl中包含2×PCR反应混合物，上、下游引物各0.2 μmol/L，TaqMan探针0.2 μmol/L，模板DNA 2 μl；②反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min（检测荧光信号）；40个循环。荧光PCR仪为ABI 7500；PCR试剂为ABI Taqman Universal PCR Master Mix；引物、探针由北京擎科生物技术公司合成，序列见表 1。Ct值为15～30，且有标准的“S”形曲线，诊断为阳性。

表 1 DEC 毒力基因引物探针序列

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1. DEC检出及基因型：采用 Real time-PCR检测6 370份样本，253份检出DEC，阳性检出率为4.0%，共分离到262株DEC。其中EPEC位居第一位占42.8%，包括不典型EPEC（eae阳性）42.0%，典型EPEC（eae和bfbA均阳性）0.8%；其次为ETEC 38.9%（耐热肠毒素基因st阳性24.8%，不耐热型肠毒素基因 lt阳性9.9%，st和lt均阳性4.2%）、EAEC 15.3%、EIEC 2.68%；1株产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）（eae和stx1均阳性），血清型为O26 ∶ K60（表 2）。

表 2 北京地区262株DEC毒力基因分布

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2. DEC混合感染：阳性标本中有9份检测到两种致病型DEC混合感染。其中ETEC＋EAEC混合感染4例，EPEC＋EAEC混合感染3例，EPEC＋ETEC混合感染2例。

3. 血清型分布：262株只有19株菌确定为13种血清型。分别为①EPEC：4株O55 ∶ K59（B5），O26 ∶ K60（B6）、O125 ∶ K70（B15）各2株及O126 ∶ K71（B16）、O128 ∶ K67（B12）、O44 ∶ K74（L）、O114 ∶ K90和O119 ∶ K69（B14）各1株；②ETEC：1株O15 ∶ K?；③EIEC：O28 ∶ K73、O164 ∶ K?、O124 ∶ K72、O29 ∶ K?和O26 ∶ K60（B6）各1株。绝大部分菌株无法分型。

4. DEC感染特征： （1）人群分布：262株DEC分离自男性150株，女性103株（含混合感染），性别比为1.5 ∶ 1。感染人群平均年龄31.4岁；职业分布以家务及待业人员最多（50例），其次为散居儿童（33例）。细菌性腹泻在各年龄组均有发病。其中以20～39岁年龄组为主，发病2 621例，占总发病人数的41.1%（2 621/6 370），DEC 阳性病例为121例，阳性率为4.6%；其次为40～59岁组和0～5岁组，发病人数分别为1 303例和1 170例，DEC 阳性病例分别为48例和39例，阳性率分别为3.7%和3.3%；6～19岁和≥60岁组发病人数较少（表 3）。各年龄组不同型别病原检出率有差异，EPEC、ETEC和EAEC在各年龄组均有检出。ETEC以6～19岁年龄组检出率最高（2.3%），0～5岁组最低（0.5%），差异有统计学意义；EPEC和EAEC虽在各年龄组均有检出，但差异无统计学意义。

表 3 2012－2013年北京地区不同年龄组腹泻病例DEC检出率

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图 1 2012－2013年北京地区不同时间（月）各型别DEC检出情况

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本研究262株DEC以EPEC和ETEC为主要型别，血清分型后只有19株能明确O抗原型别。据2010－2011年北京地区监测结果，用现行的血清分型方法共检测出77株DEC，阳性检出率为1.6%（77/4 803）^[3]，明显低于本研究用毒力基因分型的检出率（4.0%），DEC 在主要肠道致病菌中的检出比例由2010年的7.5%上升至2013年的32.0%，与国内其他研究报道基本一致^{[4, 5, 6]}。表明临床单独采用血清学诊断可能造成大量病例的误检和漏检。 EPEC是北京地区DEC流行的优势型别，在检出的112株EPEC中，98.2%为非典型EPEC，只有1.8%为典型EPEC。既往研究报道，典型EPEC一直是发展中国家婴幼儿腹泻的主要病原菌，而非典型EPEC则是在发达国家的腹泻人群或健康儿童中高发^{[7, 8]}。但近来研究数据显示，非典型EPEC在发展 中国家和发达国家普遍流行，发病率明显高于典型EPEC^[9]。但在我国非典型EPEC的研究报道较少，而在北京地区散在流行，可能提示存在菌型的变迁。国内极少开展EAEC分子生物学检测，北京地区既往也无人群感染数据。本研究还检出1株STEC（血清型为O26 ∶ K60），目前国际上报道的非O157型STEC菌株主要血清型为O26、O111、O103和O145等，有超过100种非O157型STEC能引起人类疾病^[10]。我国江苏等地发现的O26型STEC多为牲畜和食品来源^[11]，鲜有人感染的报道。本研究还在同一份标本中发现DEC多种型别混合感染。2011年德国暴发的O104 ∶ H4感染疫情表明此为EHEC家族中一名新成员，约80%的基因来自O104 ∶ H4型菌，约20%的基因来自另一种大肠埃希菌。目前仍未找到其疫情传播的源头和特效治疗方法^[12]。 以往研究表明^[6]，我国DEC感染者中，50%为5岁以下婴幼儿。本研究显示，以中年人（20～39岁）和青少年（6～19岁）检出率高，婴幼儿和老年人检出率低，但差异无统计学意义。 （感谢北京市大兴、丰台、通州、昌平、朝阳、西城区疾病预防控制中心相关人员在病例收集、流行病学调查及标本检测等方面付出的工作）