陕西省鼠疫疫区位于该省西北部的定边县境 内，处于鄂尔多斯高原荒漠草原长爪沙鼠（Meriones unguiculatus）鼠疫自然疫源地的南部边缘地带，历次 监测共发现啮齿动物6科7亚科18属23种，以长爪 沙鼠为优势种，其他小型啮齿动物主要有子午沙鼠 （Meriones meridianus） 、黑 线 仓 鼠（Circetidae barabensis）、小毛足鼠（Phodopus roborovskii）、三趾跳 鼠（Dipus sagitta）、五趾跳鼠（Allactaga sibirica）、小家 鼠（Mus musculus）等。家栖鼠类有褐家鼠（Rattus norvegicus）、小家鼠等。疫源地内空间结构复杂多 样，但性质稳固。目前在疫源地鼠疫宿主动物分类 中仍存在分歧，如2010年监测中发现疑似东方田鼠 （Microtus fortis），后经分子生物学鉴定，成为陕西省 鼠疫疫源地首次发现^[1]。

DNA条形码技术（DNA barcoding）^[2,3]是一种通 过标准DNA片段快速、准确识别或鉴定物种的技 术，目前在动物分类中最常用的基因序列是线粒体 细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基（COⅠ）序列。该技术的 优点在于物种鉴定无需依靠形态特征，对幼体、残体 甚至生物痕迹同样能准确鉴定，发现形态上保守的 “隐存种”（cryptic species）^[3]。此外该技术还能准确 评估区域内物种遗传多样性^[4]，并进行有效监测^[5]， 通过宿主动物的识别准确评估疫情性质^[6]。基于此 本研究运用DNA条形码技术对陕西省定边县鼠疫 疫区3目6科6亚科12属14种139只宿主动物及62 份残体标本进行鉴定，建立陕西省鼠疫疫源地宿主 动物DNA条形码数据库。 材料与方法

1. 材料：在定边县不同地理区域现场布点，捕鼠 疫宿主动物获取肝脏及残体组织（表 1）。

表 1 陕西省定边县鼠疫疫源地采集宿主动物的肝脏及残体组织分布

表选项

2.方法：

（1）基因组DNA提取、PCR扩增及序列测定：使 用德国Qiagen公司生产QIAamp DNA Mini Kit试剂 盒，提取肝脏及残体组织中的总DNA，应用Infinite 200酶标仪NanoQuant测定其DNA含量，通过PCR 扩增COⅠ基因，通用引物序列见表 2 ^[7]。反应体系： 2×Taq Mastermix12.5μl，上下游引物各1μl，模板 2 μl，补水至25 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性 5min，94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸 1min，共35个循环。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳分析，若电泳图中出现目标带即送样进行双 向测序。扩增时先选用COⅠ基因通用引物，如扩增 反应失败时，选用鸡尾酒引物^[8]，其中LepF1_t1、 VF1_t1、VF1d_t、VF1i_t1 的 比 例 及LepRI_t1、 VR1d_t1、VR1_t1、VR1i_t1的比例均为1∶ 1∶ 1∶ 3， 引物序列见表 2。

表 2 扩增COⅠ基因的PCR引物序列

表选项

（2）序列分析：用Chromos软件观察评价测序峰 图质量，如果峰图质量差，不能准确判断碱基，则重 新进行扩增和测序。将测定序列在NCBI上运行 BLAST程序进行序列同源性比较。运用Mega5.0 软件比对各基因序列的碱基组成和变异，删除序列 两 端 不 能 完 全 对 齐 的 碱 基。基 于Kimura-2-parameter（K2P）^[9]模型计算各物种的遗传距离；采用 邻接法构建全部COⅠ基因序列的NJ系统树，对NJ 树进行内部分支检验与1000次Bootstrap检验分 析，确定各支系的置信度^[10]。 结 果

1. COⅠ基因序列分析：对陕西省定边县鼠疫疫 区宿主动物3目6科6亚科12属14种139只鼠样本 COⅠ基因进行序列分析，序列比对结果见表 3。发 现同属各种间COⅠ序列的差异度为8.9%～15.1%， 种内COⅠ序列差异度≤2%。139份样本COⅠ基因 序列的遗传距离见图 1。

表 3 陕西省定边县鼠疫疫源地宿主动物样品测序比对

表选项

图 1 陕西省定边县鼠疫疫源地139份鼠形动物样本的遗传距离

图选项

2. 宿主动物NJ系统树构建：陕西省定边县鼠疫 疫源地3目6科6亚科12属14种139只宿主动物分 为14个不同的类群（图 2）。

图 2 陕西省定边县鼠疫疫源地鼠形动物NJ系统树

图选项

3. 黄鼠COⅠ基因序列鉴定：在COⅠ基因序列 分析时，发现陕西省定边县黄鼠与宁夏地区黄鼠 样品的相似度＞98%，而与内蒙古地区黄鼠样品的 相似度仅为92%～93%；运用Mega5.0软件基于 Kimura-2-parameter（K2P）^[9]模型计算各样本的遗 传距离，显示定边黄鼠与宁夏阿拉善黄鼠遗传距 离≤1.8%，与内蒙古达乌尔黄鼠遗传距离为8%～ 9%。从Mega5.0软件构建的黄鼠NJ系统树可见 （图 3），采自宁夏、陕西定边、内蒙古地区的黄鼠样 本形成2个高支持度的单一分支，陕西定边黄鼠样 本与内蒙古达乌尔黄鼠样本分成2个独立分支，但 与宁夏阿拉善黄鼠样本聚为一类。

图 3 陕西定边黄鼠与宁夏阿拉善黄鼠、内蒙古达乌尔黄鼠 的NJ聚类图

图选项

2002年Tautz等^[11]将DNA序列用于生物分类。 随后，加拿大动物学家Hebert等^[2]在鸟类研究中正 式提出DNA条形码的概念，并对脊椎动物和无脊椎 动物共11门13320个物种的COⅠ基因序列比较分 析，发现可以利用该基因一段长648bp的片段的 DNA碱基序列差异，进行物种的分类识别。除腔肠 动物外，98%的物种种内的差异为0～2%；种间差异 平均为11.3%。对于大部分动物群体而言，均可利 用COⅠ基因序列作为识别条形码^[3]。

本研究对陕西省定边县鼠疫疫区3目6科6亚 科12属14种139只宿主动物以及7个鼠种8个不同 部位的62份残体标本COⅠ基因进行序列分析，发 现种内遗传距离为0～2%，种间遗传距离为8.9%～ 15.1%，种间遗传距离显著大于种内遗传距离；14种 宿主动物NJ系统树可区分14个不同的类群；采集 的残体标本除剪断的毛发外，均能检测到目的基 因。不仅肝脏，其他一些部位也可作为分类标本，准 确识别宿主动物。

形态学分析是鉴定啮齿动物常用的基本方法。 由于宁夏阿拉善黄鼠与内蒙古达乌尔黄鼠在形态 学方面有较多相似，采用常规形态学方法难以区分 鉴定。本研究经序列比对发现，陕西定边黄鼠与宁 夏阿拉善黄鼠样品相似度＞98%，而与内蒙古达乌 尔黄鼠样品的相似度仅为92%～93%，因此将陕西 省鼠疫疫区多年命名的达乌尔黄鼠更名为阿拉善 黄鼠。

NJ系统树分析显示所有个体形成14个高分化 度的单一分支，但在黑线仓鼠物种分支内出现小支 系，分支间个体的遗传距离为8.9%～10.2%，本研究 发现种间遗传距离为8.9%～15.1%，说明黑线仓鼠 可能存在隐存种，但还有待进一步论证。

Hebert等^[2,3]曾分析GenBank中同属物种的 COⅠ序列数据，发现同属不同种间COⅠ序列的平 均差异度为11.3%，种内差异度＜2%，且绝大部分＜ 1%。马英等^[12]在利用DNA条形码技术分析青海省 海东地区小型兽类鉴定时发现，种内遗传距离≤ 3%，种间遗传距离为5%～10%，说明DNA条形码数 据积累的物种判断阈值可能会对物种多样性造成一 定的误判，为此还应寻找更多的能够进行分类的基 因片段。DNA条形码技术可克服形态学鉴定的不 足，用于鼠疫疫区宿主动物及残体标本的分类鉴定， 但现阶段由于数据库中缺乏足够的序列信息，故还 需与经典分类结合使用。