鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）基因组中包含3个规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）位点（YPa，YPb和YPc）。本研究对云南省不同生态型鼠疫菌株的CRISPR序列进行分析，了解不同鼠疫疫源地及鼠疫菌株间的相互联系。

　　1. 材料与方法：

　　（1）菌株来源及DNA制备：选取云南省171株鼠疫菌，其中剑川县野鼠菌株16株、玉龙县玉龙菌株7株、家鼠菌株148株。菌株保存于云南省地方病防治所。采用德国Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取鼠疫菌株DNA，置-20 ℃保存。

　　（2）CRISPR位点PCR扩增及测序：3个CRISPR位点引物设计参照文献^[1]。PCR反应体系：Premix Ex Taq 15 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl，去离子水13 μl，模板DNA 1 μl。PCR扩增：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物由北京睿博生物技术有限公司进行序列测定。

　　（3）序列分析：通过CRISPR网络服务器（http：//crispr.u-psud.fr/）中的“CRISPRs Finder”工具获得菌株间区序列信息。运用Cui等^[2]提出的命名方法及序列资料命名，确定菌株的基因簇与基因型。

　　2. 结果：

　　（1）CRISPR的间区序列种类：171株鼠疫菌中3个CRISPR位点共有间区序列18种。YPa位点包括a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a52及a73；YPb位点包括b1、b2、b3、b4及b5；YPc包括c1、c2及c3。

　　（2）CRISPR基因分型：171株鼠疫菌分为3个基因簇（Ca52、Ca8及Ca7）和4个基因型（35、30、33及22型）。其中16株剑川野鼠型鼠疫菌均为基因簇Ca52，基因型35；7株玉龙型鼠疫菌株为基因簇Ca7，基因型22；148株家鼠型鼠疫菌株均为基因簇Ca8，其中144株为基因型30，另外4株（分离自盈江县）为基因型33。

　　3. 讨论：参考Cui等^[2]提出的鼠疫菌CRISPR可能的进化模式，根据CRISPR位点进化规律，推测云南省目前所知的3个鼠疫疫源地的菌株可能由相同的祖先菌进化而来。其中玉龙鼠疫菌株（Ca7）最为古老，处于云南省鼠疫菌株CRISPR序列进化的上游。可能的进化过程为：在Ca7间区序列组合的基础上，Ca52在YPa位点上随机丢失间区序列a4并极性插入新的间区序列a52，形成野鼠型菌株间区序列组合；在Ca7间区序列组合的基础上，Ca8在YPa位点上极性插入a8，在YPb位点上极性插入b5，即形成基因型30，之后在YPa位点上再次极性插入a73，形成基因型33，即家鼠型菌株两种基因型的间区序列组合。