中华流行病学杂志  2014, Vol. 35 Issue (8): 909-912   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.08.008
中华医学会主办。
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陈敏, 王继宝, 邢辉, 马艳玲, 姚仕堂, 陈会超, 杨锦, 李艳玲, 段松, 贾曼红. 2014.
Chen Min, Wang Jibao, Xing Hui, Ma Yanling, Yao Shitang, Chen Huichao, Yang Jin, Li Yanling, Duan Song, Jia Manhong. 2014.
云南省德宏州2012年HIV-1耐药传播警戒线调查
Study on HIV-1 related genetics and threshold on drug resistance in Dehong prefecture of Yunnan province in 2012
中华流行病学杂志, 2014, 35(8): 909-912
Chinese Journal of Epidemiology, 2014, 35(8): 909-912
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.08.008

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投稿日期:2014-2-26
云南省德宏州2012年HIV-1耐药传播警戒线调查
陈敏1, 王继宝2, 邢辉3, 马艳玲1, 姚仕堂2, 陈会超1, 杨锦2, 李艳玲2, 段松2, 贾曼红1     
1. 650022 昆明, 云南省疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心;
2. 德宏州疾病预防控制中心;
3. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心
摘要目的 调查2012年云南省艾滋病高流行区德宏州未经抗病毒治疗的HIV感染者的基因型分布和耐药株传播水平。方法 根据HIV耐药警戒线调查实施方案,对2012年1-8月德宏州符合要求的60份年龄在16~25岁新发现的HIV-1感染者的血浆样本进行HIV-1耐药基因型检测和耐药株传播水平分析。结果 52份样本完成基因型及耐药鉴定,其中中国籍占59.6%,缅甸籍占40.4%。通过进化分析对pol区进行分型,38.5%的样本为独特型重组(URF),其他依次为C 亚型(34.6%)、CRF01_AE(21.2%)、CRF08_BC(3.8%)和B亚型(1.9%)。在2个序列中各检测到1个针对非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)类药物的耐药突变位点,按照耐药警戒线的统计方法估算耐药株流行率为5%~15%,属于中度水平。结论 德宏州新感染人群中存在复杂的HIV-1基因型,HIV-1耐药株已处于中度流行水平。
关键词人类免疫缺陷病毒     基因型     耐药警戒线调查     抗病毒治疗    
Study on HIV-1 related genetics and threshold on drug resistance in Dehong prefecture of Yunnan province in 2012
Chen Min1, Wang Jibao2, Xing Hui3, Ma Yanling1, Yao Shitang2, Chen Huichao1, Yang Jin2, Li Yanling2, Duan Song2 , Jia Manhong1 <    
1 Yunnan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Kunming 650022, China;
2 Dehong Center for Disease Control and Prevention;
3 National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention
Abstract: Objective To study the HIV-1 genotypes and transmitted drug resistance (TDR) in Dehong prefecture of Yunnan province in 2012. Methods Referring to the guidelines for HIV drug resistance threshold survey (HIVDR-TS),60 plasma samples of recently reported HIV-infected individuals between 16 and 25 years old were collected in Dehong prefecture from January to August 2012. Genotyping of partial pol gene was performed by using reverse transcriptional PCR. HIV-1 genotype and the prevalent levels of HIV-1 drug resistance transmission were analyzed. Results 52 plasma samples were successfully sequenced and analyzed. Among them,59.6% were Chinese,and the rest (40.4%) were Burmese. Based on pol sequences,identified HIV genotypes would include unique recombinant forms (URFs,38.5%),subtype C (34.6%),CRF01_AE (21.2%),CRF08_BC (3.8%),and subtype B (1.9%). One drug resistant mutation to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) was detected in respective two sequences. Based on the statistical method of HIVDR-TS,the prevalence of transmitted HIV-1 drug resistance was adjusted as a moderate level (5%-15%). Conclusion Diverse HIV-1 genotypes were found in this study,and the current HIV-1 drug resistant strains transmission was catalogued as moderate prevalence level in Dehong.
Key words: Human immunodeficiency virus     Genotype     Drug resistance threshold survey     Antiretroviral therapy    

耐药警戒线调查是通过在已开展抗病毒治疗的 地区对未接受抗病毒治疗的HIV感染者进行耐药检 测,判断耐药株的传播水平[1]。德宏州为云南省艾 滋病高流行地区之一,截至2011年底,德宏州累计 报告HIV/AIDS超过15000人,占云南省的16.7%; 累计抗病毒治疗4137人,占云南省的17.9%。为评 价德宏州HIV-1基因型及耐药株的流行情况,保证 抗病毒治疗的科学性和可持续性,本研究对2012年 德宏州HIV-1基因型及耐药传播水平进行调查。 对象与方法

1. 研究对象:按照《全国艾滋病病毒耐药性监测 指南》耐药警戒线调查的要求,2012年1-8月在云 南省德宏州连续收集16~25岁HIV新发现感染者 血浆样本,排除不满足要求的样本后获得60份血浆 样本。排除标准:①既往有HIV阳性检测记录;②既 往接受过抗病毒治疗;③有WHO提出的Ⅲ期或Ⅳ 期临床症状;④CD4+T淋巴细胞计数<200cell/μl。 调查对象均签署知情同意书。

2.检测方法:

(1)HIV-1RNA的提取:使用德国Qiagen公司 QIAamp Viral RNA试剂盒,根据标准操作程序从 140μl样本中提取HIV RNA。

(2)巢式PCR扩增pol基因区:使用TaKaRa公司 One Step RNA PCR试剂盒(AMV),进行反转录及 第1轮PCR扩增,反应总体系25μl,引物为MAW26 和RT21(表 1)。使 用 天 根 公 司2×Taq PCR MasterMix试剂盒,进行第2轮PCR扩增,反应体系 50μl,引物为PRO-l和RT20(表 1)。扩增产物长度 为1.3kb,包括蛋白酶(PR)基因全长(1~99密码子) 和反转录酶(RT)基因1~300密码子。

(3)PCR扩增产物电泳测序:使用1%琼脂糖凝 胶电泳观察PCR产物条带,阳性样本送北京梓熙生 物科技公司纯化和测序。采用3个正向测序引物 PROS3、RTAS、RTB和2个反向测序引物PROC1S、 RT20S3(表 1)。

表 1 HIV-1扩增及测序引物

3. 序 列 分 析:使 用Gene Codes公 司 的 Sequencher5.0软件进行序列拼接,Bioedit软件进行 多序列比对和序列整理。使用Mega5.1软件采用邻 接法构建系统进化树,重复运算1000次进行分型验 证。所得序列利用HIV耐药数据库(hivdb.stanford. edu)的 校 正 群 体 耐 药 分 析 工 具[the calibrated population resistance(CPR)tool]在线贴网分析[2], 参 照2009版 监 测 相 关 的 耐 药 突 变(Surveillance Drug Resistance Mutations,SDRM)列表[3],确定耐药 突变位点和对各种抗病毒药物的耐受程度。

4. HIV-1耐药株传播水平分析:根据WHO的 HIV耐药警戒线调查方案,采用截断顺序抽样法 (TSS)进行抽样[1],并结合“耐药警戒线监测抽样表” 进行耐药株传播水平分析。传播水平分为低传播水 平(<5%)、中度传播水平(5%~15%)和高度传播水 平(>15%)。

5. 统计学分析:应用SPSS19.0软件进行统计学 分析,率的比较采用χ 2检验。出现理论频数<5时, 采用Fisher精确χ 2检验。 结 果

1. PCR扩增及测序:60份新报告的HIV感染者 血样经扩增和测序,52份样品获得可分析的pol区序 列,满足耐药警戒线统计分析的要求。52例感染者 中,男女性比例为1.26∶ 1,年龄17~25岁,M=22 (P25=20,P75=23)岁。传播途径分布为异性传播为 主,占61.5%(32/52),静脉注射吸毒传播占30.8% (16/52),同性传播占7.7%(4/52);异性传播中, 81.3%(26/32)有非婚异性性接触史,18.7%(6/32)是 由阳性配偶/固定性伴感染。民族以汉族(46.2%, 24/52)、傣族(26.9%,14/52)和景颇族(21.2%,11/52) 为主,其他民族占5.8%(3/52)。职业以农民为主 (73.1%,38/52),其他职业占26.9%。52例感染者中, 中国籍占59.6%(31/52),缅甸籍占40.4%(21/52)。其 中缅甸籍感染者中61.9%(13/21)为强制/劳教戒毒人 员,14.3%(3/21)为检测咨询者,14.3%(3/21)为孕产 期检查,4.8%(1/21)为术前检查,4.8%(1/21)为其 他。中国籍感染者主要感染途径为异性传播,缅甸 籍感染者主要为注射吸毒传播(表 2)。

表 2 德宏州52例不同国籍HIV-1感染者感染途径分布

2. 基因型分布:利用pol区序列进行分型,其中 URF占38.5%(20/52),C亚 型 占34.6%(18/52), CRF01_AE占21.2%(11/52),CRF08_BC占3.8% (2/52)和B亚型占1.9%(1/52)。检测到的URF包括 BC重组(80.0%,16/20)和C/CRF01_AE重组(20.0%,4/20)。研究对象基因型在异性传播和注射毒品传 播间差异无统计学意义,在中国和缅甸籍感染者间 差异无统计学意义(表 3)。

表 3 2012年德宏州HIV-1感染者基因型分布

3. 耐药相关突变和耐药株流行率:52份样本 中,有2份检测到各携带1个针对非核苷类反转录酶 抑 制 剂(NNRTI)的 耐 药 传 播 相 关 突 变 位 点 (SDRM),分别为K103N和Y181I。根据耐药警戒 线调查的统计方法,将获得的序列按采样时间排序, 第9和第23个序列携带SDRM,计算累计耐药样本 数并填入《耐药警戒线监测抽样表》中,达到最大样 本量47时,停止抽样,此时耐药样本累计数(2)介于 上下限之间,属HIV-1耐药株的中度流行水平 (5%~15%),见表 4、5。

表 4 2012年德宏州HIV-1感染者耐药株特征

表 5 耐药传播警戒线调查的抽样方法和传播水平划分方法
讨 论

抗病毒治疗人群的耐药监测能够揭示HIV耐药 发生、发展趋势以及影响因素。而新近感染人群的 耐药监测,可提供HIV耐药株分布和流行的情况,为 制定减少HIV耐药株传播的措施提供科学依据,指 导制定一线抗病毒治疗方案。但在实际中确定新近 感染相对比较复杂,需要结合流行病学资料和新近感染的检测来进行判断。为了满足耐药传播监测的 需要,WHO提出了耐药警戒线调查的方法,这是一 个资源最小化的监测方法,主要是将新发现的低年 龄组感染者近似地作为新近感染人 群,因为其可能暴露于HIV的年限 较短[1]

德宏州是云南省艾滋病流行时 间最长,抗病毒治疗规模较大的地 区,其耐药传播情况需要连续关注 和研究。近年来,德宏州的HIV疫 情出现一些新的变化趋势。2010 年德宏州筛查202089人次,新报告 感染者1282人,其中外籍366人, 占28.5%;2011年筛查483214人 次,新报告感染者1525人,其中外 籍595人,占39.0%;2012年筛查 711347人次,新报告感染者1341 人,其中外籍661人,占49.3%。可 见新发现感染者中外籍的构成比例 在加大,本次调查中缅甸籍的感染者占40.4%,提示跨境人口的艾滋病传播已经是一 个很突出的问题。从感染途径来看,异性传播已成 主要的感染途径,但中国籍和缅甸籍HIV感染者的 感染途径存在差异,中国籍主要为异性传播,而缅甸 籍主要为注射吸毒传播。

耐药警戒线所抽取的样本是一个近似的HIV新 近感染样本,其基因型分析能够提示HIV分子流行 病学的实时变化。在德宏州既往的调查中,C亚型 和URF分别占第一、二位[4]。而在本调查中,URF已 经上升到了第一位,表明当地不但存在着复杂的病 毒基因重组,有的重组可能已开始传播。从总体上 来说,HIV基因型在异性传播和注射毒品传播之间 的差异无统计学意义,在不同国籍感染者之间的差 异无统计学意义。

本次调查检测到2个针对NNTRI的耐药突变位 点:K103N和Y181I。根据2008年德宏州的一项调 查,抗病毒治疗>1年病毒载量超过1000copy/ml 的 患 者 中,K103N的 检 出 率 达39%(27/69),居 NNRTIs耐药突变位点首位[5]。在2011年德宏州的 耐药监测中,已发现K103N传播的情况[6]。与此相 反,Y181I在之前的耐药监测中均未报道[5, 7],并从1 名缅甸籍的IDU中检测到,提示耐药突变可能不是 来源于本地治疗人群。由于中缅两国在疫情的流行 特点和感染者的管理模式上存在差异,防止耐药株 的跨境传播应引起重视。

目前,德宏州HIV-1的主要传播途径已经由早 期的注射毒品转变为性传播,但本次调查中发现的 2例耐药毒株均为注射毒品传播。以往的调查发现 注射吸毒人群服药依从性较其他人群差[8, 9],提示该 人群产生耐药的可能性较大,加上德宏州注射毒品 传播时间较长,积累的原发性耐药比较容易通过注 射吸毒途径传播到新近感染人群中。为了证实这种 推测需要加强对治疗人群的耐药监测。

根据警戒线的判别方法,德宏州2011年耐药株 为低度流行水平(<5%)[6],本次调查提示德宏州耐 药株的流行率已属于中度水平。从该地区对治疗 艾滋病患者耐药发生的监测情况来看,HIV病毒载 量>1000copy/ml的艾滋病患者中HIV耐药株检出 率较高[7]。因此当前控制耐药株传播的关键,是进 一步加强抗病毒治疗人群的规范治疗及科学管理, 同时通过有效的干预来降低危险行为,减少新发感 染。为全面了解耐药传播的情况,还需要开展连续 耐药监测。

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