原发性肝癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展过程复杂，多种因素共同参与，具体机制目前仍不清楚[1]。世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》显示，我国肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。大量的研究表明，Hedgehog(Hh)信号通路的异常与多种肿瘤的发生发展密切相关，且其作用可能受组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的调节。在人原发性肝癌中，Hh信号通路异常表达，并通过调节自噬参与到HCC的发生发展中；在胰腺导管腺癌小鼠模型中发现，SHH信号使骨髓细胞中血管生成素Ang-1和胰岛素样生长因子IGF-1表达增加，促进肿瘤组织血管生成；在神经前体细胞和成神经管细胞瘤中，高表达的HDAC1和低表达REN能够影响Hedgehog信号通路；在胰腺癌和胃癌的发生发展中，SHH/Gli信号通路能影响包括TGF-β、Ras、Wnt、Smads、生长因子、整合素等多种信号通路，增强肿瘤细胞的侵袭迁移能力。Hedgehog信号通路参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡，并促进血管形成，影响肿瘤细胞的侵袭及迁移过程。因此针对Hh信号通路的靶向抑制为我们抗肿瘤治疗提供了新的研究方向。
蜂毒是工蜂毒腺和副腺分泌的具有芳香气味的一种透明液体。我国有着悠久的利用蜂毒治疗疾病的历史。近年来随着分离、纯化技术水平的不断提高，作为蜂毒主要组分及重要的活性成分，蜂毒素被不断开发并广泛应用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、三叉神经痛、偏头痛等疾病的治疗[2, 3]。其能够通过多种途径影响细胞的信号传导，诱导神经酰胺合成及细胞凋亡，由此引发抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物效应，引起广泛关注。蜂毒素具有的抗肿瘤作用，呈多靶点性，可能与其直接杀伤细胞，诱导细胞凋亡，调节免疫及非特异性免疫功能有关，但其具体机制未明。本实验观察蜂毒素对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用和其促进凋亡作用，并探讨该作用与HDAC2及Hedgehog信号通路的关系。
1 材料 1.1 细胞株HepG2细胞由安徽医科大学基础医学院神经药理学研究所提供。
1.2 试剂和仪器RPMI 1640培养基由Hyclone公司提供，胎牛血清购于杭州四季青公司，MTT和DMSO,PTCH1、SMO、Gli1 抗体均由Sigma公司提供，Hoechst 33258染色试剂盒及Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物，逆转录试剂盒购自MBI Fermentas公司，QuantiFast SYBR-Green RT-PCR试剂盒由QIAGEN公司提供，TRIzol Reagent及引物合成由上海Invitrogen公司提供，β-actin 抗体购自美国Cell Signaling Technology，SHH抗体由北京博奥森生物有限公司提供，羊抗小鼠和羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司。二氧化碳培养箱(Thermoforma)，荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，酶标仪(biotekEL)，流式细胞仪(FACSVERSE)，qRT-PCR仪(Thermo Fisher Scientific)，Western blot仪器(Bio-Rad)。
2 方法 2.1 HepG2细胞的培养采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(105 U·L-1青霉素和 100 g·L-1链霉素)，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，细胞为贴壁生长，胰酶消化液消化后传代培养，实验取用对数生长期细胞。
2.2 细胞增殖实验以MTT比色法检测HepG2细胞的增殖。实验分为4组：空白对照组，低、中、高3个浓度组。将培养的HepG2细胞胰酶消化制备成细胞混悬液，每孔以细胞数4 000接种于96孔板中。细胞贴壁后，分别给予0、1、2、4 mg·L-1蜂毒素，作用48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，继续孵育培养4 h后，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解后，酶标仪492 nm波长处检测各孔吸光度，按公式计算蜂毒素对细胞的生长抑制率，生长抑制率/%=(1-OD给药组/OD对照组)×100%。
2.3 细胞凋亡实验 2.3.1 Hoechst 33258染色法观察细胞核的形态变化实验分为4组：空白对照组，蜂青素低、中、高3个浓度组。将培养的HepG2细胞胰酶消化后，制备成细胞混悬液，每孔以细胞数4 000接种于6孔板中。细胞贴壁后，分别给予0、1、2、4 mg·L-1蜂毒素，作用48 h后，将1/10细胞培养基体积的染料加入细胞培养物中，37℃继续培养细胞15 min，PBS洗2遍，荧光倒置显微镜下，随机选取4个视野，观察细胞核的形态变化并计数，计算凋亡率，凋亡率/%=(凋亡细胞/细胞总数)×100%。
2.3.2 AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡实验分为4组：空白对照组，蜂毒素低、中、高3个浓度组。细胞制备成悬浮液后，以细胞数4×105接种至细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，换液，实验组分别给予1、2、4 mg·L-1蜂毒素，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，离心收集悬浮细胞。离心机300×g，2℃~8℃，5 min，弃培养基，PBS洗涤2次，重新离心收集细胞。用400 μL 1× Annexin V 结合液悬浮细胞，浓度大约为1×109 cells·L-1。在细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC 染色液，轻轻混匀后于2℃～8℃避光孵育15 min；加入10 μL PI 染色液后轻轻混匀于2℃～8℃避光孵育5 min；处理结束后，使用Beckmann流式细胞仪，488 nm激发波长，按照常规流式凋亡检测。
2.4 qRT-PCR检测SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2mRNA的表达实验分为4组：空白对照组，蜂毒素低、中、高3个浓度组。给药刺激48 h后，按TRIzol试剂盒操作说明，提取细胞总RNA。提取的总RNA按Fermentas逆转录试剂盒操作说明，将9 μL总RNA逆转录为cDNA。本实验qRT-PCR引物序列见Tab1。采用QuantiFast SYBR-Green RT-PCR试剂盒，按2 μL cDNA、3 μL引物、5 μL SYB体系检测SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2mRNA的表达，以β-actin做内参，使用PikoReal 96 Real-Time PCR 系统软件对实验结果进行分析。重复3次独立实验。
| Gene | Forward primer | Reverse primer |
| SHH | 5′-ACTCACCCCAATTACAACC-3′ | 5′-GTCACCCGCAGTTTCACTC-3′ |
| HDAC2 | 5′-CGTAATGTTGCTCGATGTTGG-3′ | 5′-TCTGGAGTTTCTGGTTTGTCA-3′ |
| PTCH1 | 5′-GACCGGGACTATCTGCA-3′ | 5′-GAGGAGGCCCACAACC-3′ |
| SMO | 5′-GGCTGGTGTGGTTTGGTTTGT-3′ | 5′-GTGAGCAGGTGGAAGTAGGAGGT-3′ |
| GLi1 | 5′-ATGAATCACCAACACCAG-3′ | 5′-CTTGACGCATCCTAATCC-3′ |
| β-actin | 5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′ | 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′ |
实验分组同上，给药刺激48 h后，用预冷的PBS洗3次，每组加入400 μL RIPA蛋白裂解液(含PMSF 10 mL·L-1),冰上裂解30 min。4℃离心30 min，留取上清液。加入1/4体积上清液的蛋白上样缓冲液，100℃水浴10 min，-20℃保存。配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每组上样15 μL总蛋白，80V电泳30 min后，120V电泳90 min。按蛋白marker位置切胶，200mA，BioRAD湿转仪器将蛋白转到激活后的PVDF膜上，根据蛋白分子量大小不同，SHH、PTCH1、SMO、 Gli1、HDAC2蛋白转膜时间依次为55、220、110、150、75 min；室温5%脱脂奶粉，1×TBS，0.1%吐温-20封闭3 h，1×TBS，0.1%吐温洗膜后孵育一抗，一抗浓度为SHH(1 ∶ 200)、 PTCH1(1 ∶ 250)、SMO(1 ∶ 500)、Gli1(1 ∶ 500)、HDAC2(1 ∶ 1 000),4℃过夜。1×TBS，0.1%吐温洗膜4次，每次10 min，放入与一抗匹配的二抗(1 ∶ 7 500)中孵育，室温1 h，1×TBS，0.1%吐温洗膜4次，每次10 min，ECL发光试剂盒显影，以β-actin做内参，分析条带吸光度值。
2.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对实验所得数据进行分析。结果以
± s表示，两组间比较采用t检验，3组及以上比较采用方差分析。
在给予不同浓度的蜂毒素分别作用24、48、72 h后，MTT比色法检测结果显示：给予HepG2细胞1,2,4 mg·L-1蜂毒素作用24 h后，各剂量组细胞生长的抑制率分别为28.7%，29.4%，38.4%；作用48 h后各剂量组抑制率为29.3%，37.5%，49.8%；作用72 h后各剂量组抑制率为17.8%，27.0%，36.1%(Fig1)。实验结果表明，蜂毒素对HepG2细胞的增长有明显的抑制作用，且随给药剂量递增，抑制作用越明显。因为各剂量组抑制率在作用48 h后最高，所以后续实验均采用给药后48 h进行检测。以上实验结果至少重复3次。
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| Fig 1 Inhibitory effect of Melittin on HepG2 cells protiferation *P < 0.05，**P < 0.01 vs blank control |
在给予不同浓度的蜂毒素作用48 h后，Hoechst 33258染色结果显示：见
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| Fig 2（A） Hoechst 33258 staining results of HepG2 cells (200×) A: 0 mg·L-1， B: 1 mg·L-1，C: 2 mg·L-1，D: 4 mg·L-1;*P < 0.05，**P < 0.01 vs blank control |
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| Fig 2（B） Effect of apoptosis on HepG2 cells *P < 0.05，**P < 0.01 vs blank control |
在给予不同浓度的蜂毒素作用 48 h后，采用qRT-PCR的方法检测Hedgehog信号通路SHH、PTCH1、SMO及GLi1 mRNA的表达，结果显示：与空白对照组相比，PTCH1 mRNA表达降低，并且蜂毒素高浓度组(4 mg·L-1)差异有显著性(P < 0.01)，同时，SHH、SMO、Gli1 mRNA 的表达均降低，且蜂毒素中、高浓度组(2、4 mg·L-1)差异均具有显著性(P < 0.01)。实验结果表明，蜂毒素能明显抑制SHH、PTCH1、SMO、Gli1 mRNA 的表达，见Fig3。所有实验结果至少重复3~4次。
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| Fig 3 mRNA expression of SHH, PTCH1, SMO and GLi1 in HepG2 cells **P < 0.01 vs blank control |
在给予不同浓度的蜂毒素作用48 h后，Western blot 检测 Hedgehog信号通路相关蛋白表达，结果显示：与空白对照组相比，PTCH1 蛋白表达降低，并且蜂毒素高浓度组(4 mg·L-1)差异有显著性(P < 0.05)，同时，SHH、SMO、Gli1 蛋白表达均降低，且蜂毒素中、高浓度组(2、4 mg·L-1)差异均具有显著性( P < 0.01)，这一结果同qRT-PCR结果相符。实验结果表明，蜂毒素能明显抑制SHH、 PTCH1、SMO、Gli1蛋白的表达。见Fig4。所有实验结果至少重复3~4次。
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| Fig 4 Protein expression levels of SHH, PTCH1, SMO and GLi1 in HepG2 cells *P < 0.05, **P < 0.01 vs blank control |
在给予不同浓度的蜂毒素作用48 h后，qRT-PCR及Western blot 检测HDAC2 mRNA和蛋白的表达，结果显示：与空白对照组比较，HDAC2 mRNA表达降低，且同给药浓度呈负相关，差异具有显著性(P < 0.01)；Western blot也得到了相类似的结果(P < 0.05)。实验结果表明，蜂毒素能明显抑制HDAC2的表达。见Fig5、6。以上实验结果至少重复3~4次。
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| Fig 5 mRNA expression levels of HDAC2 in HepG2 cells **P < 0.01 vs blank control |
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| Fig 6 Protein expression levels of HDAC2 in HepG2 cells *P < 0.05 vs blank control |
Hedgehog信号通路主要由Hh配体、Patched(Ptc)受体、Smoothened(SMO)跨膜蛋白、核转录因子Gli(glioma-association oncogene homoglog)构成。其中Hh配体有3种，SHH、IHH和DHH，目前研究发现在原发性肝癌中发挥主要作用的是SHH[4]。Ptc受体有两种，分别为Ptch1和Ptch2，二者均能同Hh配体结合，负调控Hedgehog信号通路。当Hh配体未被激活时，Pth同SMO结合，抑制SMO活性，但是当Hh同Ptc结合后，解除了后者对SMO的抑制作用，SMO信号传达到胞内，激活GLi。Chung等[5]研究发现过表达与PTCH1同源的PTCH53能够通过抑制SMO抑制Hh信号通路。Jeng等[6]在HCC小鼠模型上证实抑制SHH能够抑制肿瘤的生长，降低Gli1 mRNA的表达。GLi是一个具有锌指结构的转录因子，目前发现，Gli包括Gli1、Gli2和Gli3，其中Gli1是转录激活因子，其活化能够诱导靶基因的转录，是Hh信号通路激活的重要标志。Hedgehog信号通路在肝癌中异常表达，Che等[7]发现Hedgehog信号通路中GLi1在HCC的发生发展中扮演重要角色，Huang等[8]发现，使用环靶明或KAAD-环靶明抑制SMO,能抑制Hep3B、Huh7以及PLC/PRF/5细胞的增殖，促进其凋亡。
虽然Hedgehog信号通路与HCC的发生密切相关,但该通路到底通过何种机制促进肿瘤的发生发展仍不清楚。Chen等[9]发现抑制Gli1后，MMP-2、9上调，并阻断EMT、VEGF 从而抑制肝癌细胞的转移和侵袭；同样沉默GLi2后，能够下调cyclinD1、cyclinE2，上调p21-WAF1，从而抑制细胞增殖；同时降低c-FLIP和Bcl-2，激活Caspase-8/9和Caspase-3，诱导核糖聚合酶(PARP)裂解,促进凋亡[10]。最新研究发现，丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及激酶蛋白CK2α能够调节GLi1，共同参与了肝癌的发展进程[11, 12]。Hedgehog信号通路在HCC中的作用已被广泛证实，其与其它信号通路的关联值得我们进一步探讨，同时也为我们提供了新的抗肿瘤药物研发方向。
近年来，人们越来越多的将抗肿瘤药物着眼于天然药物的开发。自蜂毒素被发现具有抗肿瘤作用以来，其作用机制一直在不断探索。蜂毒素能够通过抑制NF-κB和AP-1依赖的MMP-9的表达抑制肿瘤的侵袭，并通过阻断VEGFR2/COX-2介导的MAPK信号通路和抑制ERK和mTOR通路抑制HIF-1α/VEGF表达抑制肿瘤生长[13]。蜂毒素对肝癌也有明确的作用，蜂毒素能明显抑制人肝癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其作用机制可能与下调IL-8和VEGF的表达，抑制肿瘤血管生成有关；蜂毒素还可通过激活CaMKII-TAK1-JUK/P38和抑制NF-κB诱导HCC的凋亡[14]。本实验通过不同给药浓度的蜂毒素对SHH、PTCH1、SMO、GLi1的作用证实，蜂毒素可能通过Hedgehog信号通路抑制人肝癌HepG2细胞增殖，促进其凋亡。
HDACs 为组蛋白去乙酰化酶，其主要的功能是从 N-乙酰赖氨酸中删除乙酰基团。研究显示异常表达的HDAC2能够调节人肝癌细胞增殖，并影响肿瘤细胞周期。Gianluca 等[15]证实Gli1和Gli2是被乙酰化了的蛋白，HDACs介导的去乙酰化作用能够促进GLi1和GLi2的激活，沉默HDAC能抑制Hedgehog信号通路诱导的肿瘤细胞增殖。Noh等[16]发现异常表达的HDAC2能调节G1/S期细胞周期蛋白，影响HCC的增殖；同时研究发现在肿瘤迁移侵袭过程中调节细胞分化的脱乙酞酶的抑制剂(HDACi)帕比司他在HepG2、HPe3B细胞中的剂量与SHH、SMO、Pct.、GLi1的表达负相关[17]。本研究中Western blot及qRT-PCR结果显示，与空白对照组比较，蜂毒素能降低HDAC2的表达水平，同时实验结果显示Hedgehog信号通路中GLi1水平明显降低，与Gianluca结果一致，提示蜂毒素可能是通过调控HDAC2影响Hedgehog信号通路。
本实验从细胞分子水平证实蜂毒素对人肝癌细胞HepG2的增殖和凋亡具有调控作用，其作用可能和抑制Hedgehog信号通路相关，并且发现蜂毒素能够抑制组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)，且呈剂量负相关，提示Hedgehog信号通路可能受乙酰化影响，蜂毒素对HDAC2作用及后者对Hedgehog信号通路的调控和具体机制，后期将进一步深入研究。
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