2020, Vol. 40 
表1(Table 1)
苯甲酸又称安息香酸，分子式为C6H5COOH，是苯环上的1个氢被羧基（-COOH）取代形成的化合物，其以游离酸、酯或其衍生物的形式广泛存在于自然界中，主要用于抗真菌及消毒防腐，用于医药、染料载体、增塑剂、香料和食品防腐剂等的生产，也用于醇酸树脂涂料的性能改进，也作为钢铁设备的防锈剂、农业化学品。
苯甲酸收载于2015年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）二部[1]、食品添加剂标准[2]、饲料添加剂标准[3]、欧洲药典（EP）9.0版[4]、美国药典（USP）41-国家处方集（NF）36版[5]、英国药典（BP）2018年版[6]、日本药局方（JP）17版[7]以及食品化学法典（FCC）第5版[8]中，但各国药典均未对苯甲酸有关物质进行检查，仅食品添加剂及饲料添加剂的标准对5种联苯类物质（联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯）进行了控制。
苯甲酸的工业生产方法主要为甲苯液相空气氧化法[9]，此外还有三氯甲苯水解法以及邻苯二甲酸酐脱羧法等[10]。苯甲酸的合成过程中容易引入甲苯、苯甲醛、苯甲醇以及联苯类杂质等，其直接影响到产品的安全性。目前，文献报道的检测方法主要为气相色谱（GC）法[11-15]、高效液相色谱（HPLC）法[16-19]等，但仅限于检测其中1~3个杂质成分，尚未见文献报道同时测定苯甲酸有关物质（甲苯、苯甲醛、苯甲醇以及联苯类）的测定方法。本文在前人工作基础上，建立了GC法同时测定苯甲酸有关物质（甲苯、苯甲醛、苯甲醇以及联苯类）的方法。结果表明，所建立的方法简便、快捷、结果准确，能有效控制药品质量。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦7890B气相色谱仪，梅特勒XP205电子分析天平。
1.2 药品与试剂苯甲酸样品：样品1（厂家A，批号1160701，原料药），样品2（厂家A，批号1180103，原料药），样品3（厂家B，批号170901，辅料），样品4（厂家B，批号170902，辅料），样品5（厂家C，批号B803148，化学试剂），样品6（厂家D，批号1FK0073，进口辅料）；溶剂：N，N-二甲基甲酰胺（国药集团化学试剂有限公司，批号81007718，分析纯）；对照品：甲苯（Dr. Ehrenstorfer GmbH，批号30914，含量99.9%），苯甲醛（中国食品药品检定研究院，批号111650-201303，含量99.9 %），苯甲醇（中国食品药品检定研究院，批号190019-201702，含量99.8%），联苯（Stanford Chemicals，批号BPB-081078，含量99.51%），2-甲基联苯（TCI，批号OE5XH，含量98.9%），3-甲基联苯（TCI，批号ONWVE，含量95.3%），4-甲基联苯（TCI，批号4LSKC，含量98.4%），苯甲酸苄酯（Stanford Chemicals，批号BYB-577800，含量99.90%）。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Aglient DB-FFAP毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；柱温：起始温度为100 ℃，保持1 min，以5 ℃·min-1升温至230℃，保持5 min；进样口温度：270 ℃；氢火焰检测器温度：300 ℃；空气流量：400 mL·min-1；氢气流量：30 mL·min-1；载气（N2）流速：1.0 mL·min-1，分流比10：1，进样量：1 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品储备液及混合对照品溶液精密称取甲苯、苯甲醛、苯甲醇、联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯的对照品各约20 mg，放于预先盛有约3 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的10 mL量瓶中混合，然后加DMF稀释制成每1 mL中约含2 mg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液1.0 mL于100 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，即成每1 mL中约含20 μg的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液取样品0.5 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加DMF溶解并稀释制成每1 mL中约含20 mg的溶液，作为供试品溶液。
2.2.3 空白溶液空白溶液为DMF。
2.3 系统适用性试验取“2.2”项下的空白溶液、对照品溶液和供试品溶液（样品批号1160701）各1 μL，在“2.1”项色谱条件下分别进样，记录色谱图。结果显示，空白溶剂不影响测定，各溶液色谱图中相邻的峰间分离度良好，均大于2.0（图 1）；甲苯、苯甲醛、苯甲醇、联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯的理论塔板数均大于10 000。
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1.甲苯（methylbenzene）2.苯甲醛（phenylaldehyde）3.苯甲醇（benzyl alcohol）4. 2-甲基联苯（2-methyl biphenyl）5.联苯（biphenyl）6. 3-甲基联苯（3-methyl biphenyl）7. 4-甲基联苯（4-methyl biphenyl）8.苯甲酸苄酯（benzyl benzoate） a. DMF b.对照品溶液（solution of reference substances）c.供试品溶液（sample solution） 图 1 GC色谱图 Fig.1 GC chromatograms |
精密量取混合对照品储备液5、50、100、500、1 000、1 500 μL，分别置50 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液①~⑥，按上述色谱条件进样分析。以浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，结果见表 1。
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表 1 8个化合物线性关系 Tab.1 Linear relationships of 8 compounds |
将“2.4”项下的线性溶液⑥用DMF逐级稀释，进样测定。结果当信噪比约为3时，测得检测下限；当信噪比约为10时，测得定量下限。结果如表 1。
2.6 精密度试验精密量取线性溶液⑤1 μL，按“2.1”项下的色谱条件，连续进样测定6次，记录色谱图及峰面积值。结果测得甲苯、苯甲醛、苯甲醇、联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯峰面积的RSD（n=6）分别为0.31%、0.26%、0.43%、0.23%、0.24%、0.22%、0.29%、0.28%，说明仪器进样精密度良好。
2.7 稳定性试验精密量取线性溶液⑤1 μL，分别于0、8、16、24 h，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积值。结果测得甲苯、苯甲醛、联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯峰面积在24 h内的RSD分别为1.0%、0.40%、0.26%、0.33%、0.23%、0.33%、0.26%，说明其溶液在24 h内基本保持稳定，苯甲醇的峰面积在16 h内的RSD为0.12%，说明其溶液在16 h内基本保持稳定。
2.8 加样回收试验分别精密称取已知含量的样品（批号170901）约0.5 g，共9份，依次加入“2.2.1”项下的混合对照品储备液0.20、0.25、0.30 mL，各3份，再分别加DMF稀释至25 mL，即得低、中、高3个质量浓度的供试溶液，按上述色谱条件进样测定并计算回收率。结果如表 2，表明各成分的低、中、高3个浓度回收率均在95.5%~100.4%之间，RSD在0.09%~0.98%之间，说明本方法准确度良好。
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表 2 回收率试验结果 Tab.2 Results of recovery tests |
取6批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表 3。
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表 3 6批样品中有关物质测定结果（%） Tab.3 Results of related substances in 6 samples |
由于所要检测的有关物质较多，而且3-甲基联苯、4-甲基联苯的沸点与极性相近，难以分离，在本试验中选择不同的毛细管柱进行测定，在选择PE-wax柱时，3-甲基联苯与4-甲基联苯的分离度达不到要求，在使用安捷伦-waxetr柱时，各成分分离度均达到要求，但分析时间较长，而使用安捷伦-DB-FFAP柱时，各成分分离度不仅达到要求，且分析时间控制在30 min内。
3.2 色谱条件的选择本试验检测的有关物质包括甲苯、苯甲醛、苯甲醇、联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯8个化合物，沸点范围为110~324 ℃，因此本试验采用程序升温使8个化合物在较短时间内达到良好的分离。
3.3 结论为了进一步控制苯甲酸原料药的质量，对原料药中有关物质进行测定，考虑检出的已知杂质成分的量均较小，结合2015年版《中国药典》对有关物质的限度要求与ICH杂质研究指导原则最低限度要求，甲苯的限度设为不得过0.089%，其余成分设为不得过0.1%。
本文建立了不同级别苯甲酸中有关物质甲苯、苯甲醛、苯甲醇、联苯、2-甲基联苯、3-甲基联苯、4-甲基联苯、苯甲酸苄酯的检查方法，并规定其限度，与已有方法相比，该方法简便、灵敏、专属性强，能同时测定8个成分。此外，苯甲酸在2015年版《中国药典》标准中没有设立有关物质检查项，故本法的建立有利于药品质量的有效控制。
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