2. 甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室, 兰州 730070;
3. 甘肃省河西制药有限责任公司, 张掖 734000
2. Gansu Inspection and Testing Technical Engineering Laboratory for Chinese Herbal and Tibetan Medicine, Lanzhou 730070, China;
3. Gansu Hexi Pharmaceutical Co., Ltd, Zhangye 734000, China
栀子金花丸收载于《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版一部,是由栀子、黄连、黄芩、黄柏、大黄、金银花、知母和天花粉8味中药制成的中药复方制剂,具有清热泻火、凉血解毒的功效,用于肺胃热盛、口舌生疮、牙龈肿痛、目赤眩晕、咽喉肿痛、吐血衄血和大便秘结的治疗[1]。方中黄芩中含有黄芩苷等黄酮类化合物,金银花中主要含有绿原酸、槲皮素、木犀草素、木犀草苷等有机酸、黄酮和三萜皂苷类成分,知母中含芒果苷,栀子中含有栀子苷等环烯醚萜类成分及三萜类、黄酮类成分,其中小檗碱是黄连、黄柏中的共有成分,小檗碱、黄柏碱等生物碱成分具有较强的抗菌、消炎作用,栀子中的栀子苷具有保肝利胆、抗炎、抗氧化等多种作用[2]。
对于栀子金花丸的测定,《中国药典》2015年版仅以栀子苷为指标进行含量测定,文献[3-10]采用同一波长进行测定。本文参考文献[11-15],建立HPLC-DAD法,利用DAD检测器设定3个检测通道,同时采用不同结构的化合物在不同紫外波长处检测,对栀子金花丸中含量较高的栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚10个活性成分进行含量测定,为全面评价栀子金花丸的质量以及今后质量标准的提高提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters 2695型高效液相色谱仪(2695溶剂管理系统,2996二极管阵列检测器,Empower Ⅲ色谱工作站,Waters公司);KQ-250型超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司);XR205SM-DR型十万分之一分析天平(Pricisa公司)。
1.2 对照品、样品及试剂对照品栀子苷(批号110749-201718,含量97.6%)、绿原酸(批号110753-201817,含量96.8%)、黄芩苷(批号110715-201016,含量94.4%)、芒果苷(批号110607-201702,含量100.0%)、盐酸小檗碱(批号110713-201814,含量96.7%)、盐酸黄柏碱(批号111895-201504,含量98.0%)、大黄酸(批号110756-201607,含量99.3%)、大黄素(批号110796-201512,含量98.7%)、芦荟大黄素(批号110795-201710,含量98.1%)、大黄酚(批号110796-201621,含量99.2%)均购自中国食品药品检定研究院;栀子金花丸,批号181203、181204、181205、180901、180902,由甘肃河西制药有限公司提供。
甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司),水为超纯水,其余试剂(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Luna C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 µm),以乙腈(A)-0.2%醋酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~15 min,8%A→40%A;15~20 min,40%A→ 60%A;20~30 min,60%A→90%A;30~40 min,90%A→8%A),流速1.0 mL·min-1,柱温35 ℃,检测波长258 nm(检测栀子苷、芒果苷、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚)、280 nm(检测黄芩苷、黄柏碱)、345 nm(检测绿原酸、小檗碱),进样量10 µL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品储备液分别精密称取栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚的对照品适量,加甲醇溶解并制成每1 mL分别含栀子苷657.0 μg,绿原酸418.0 μg,黄芩苷301.0 μg,芒果苷632.0 μg,盐酸小檗碱668.0 μg(小檗碱的量=盐酸小檗碱的量/1.1087),盐酸黄柏碱71.0 μg(黄柏碱的量=盐酸黄柏碱的量/1.1066),大黄酸271.0 μg,大黄素73.0 μg,芦荟大黄素41.0 μg,大黄酚101.0 μg的混合溶液,即得。
2.2.2 供试品溶液取本品适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,称量,超声处理(功率300 W,频率50 kHz)20 min,放冷,再称量,用甲醇补足减失的量,摇匀,滤过,精密量取续滤液10 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性样品溶液按照栀子金花丸的处方比例分别制备不含大黄、黄连和黄柏、黄芩、金银花、知母、栀子以及只含天花粉(无栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚10个成分)的7种阴性样品,按“2.2.2”项下方法操作,即得。
2.3 专属性试验精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液适量,用甲醇稀释100倍,配制成混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液及“2.2.2”项下的供试品溶液及“2.2.3”项下的阴性样品溶液各10 μL,按“2.1”项下色谱条件进行试验,结果见图 1、2。在上述色谱条件下,栀子金花丸中10个被测成分均达到基线分离,与其他成分之间均无明显干扰。
分别精密吸取上述混合对照品储备液适量,用甲醇逐级稀释,配制成6个不同浓度的混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,测定峰面积,每个浓度进样2次;以对照品的进样量X(μg)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,回归方程、相关系数及线性范围见表 1。取混合对照品溶液,逐级稀释并进样测定,以仪器的信噪比S/N为3时计算检测下限(LOD),以仪器的信噪比S/N为10时计算定量下限(LOQ),结果见表 1。
吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液适量,用甲醇稀释100倍,配制成的混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件下连续重复进样6次,测得栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚峰面积RSD依次分别为1.3%、0.45%、1.2%、0.63%、0.32%、1.8%、0.64%、1.3%、1.6%和0.86%,表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验取同一供试品溶液,室温下于0、2、4、6、8、10 h分别按“2.1”项下色谱条件进样测定,测得栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚峰面积RSD依次分别为1.5%、0.73%、1.1%、1.1%、1.4%、1.2%、1.6%、1.2%、0.92%和0.74%,表明供试品溶液在10 h内测定,稳定性良好。
2.7 重复性试验取同一批栀子金花丸(批号181203),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份,按“2.1”项下色谱条件进样测定,测得栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚平均含量分别为3.68、2.32、1.71、3.52、3.51、0.35、1.46、0.44、0.23、0.54 mg·g-1,RSD分别为2.0%、1.3%、2.6%、1.0%、1.6%、1.6%、2.3%、1.6%、2.2%和1.4%,表明该方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验精密量取已知含量的栀子金花丸(批号181203)9份,每份0.25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,每3份一组,分别精密加入10个被测成分的混合对照品溶液适量,按“2.2.2”项下方法,自“加入甲醇50 mL”起操作,制得低、中、高3个浓度的供试溶液各3份。按“2.1”项下色谱条件进样测定,结果见表 2,表明回收率良好。
目前,本地市场上销售的栀子金花丸均为甘肃河西制药有限公司产品,因条件所限,仅从该公司收集到5批样品,按“2.1”项方法进行10个成分的测定,外标法计算各成分的含量,结果见表 3。
在现行栀子金花丸的质量标准中,仅以栀子苷为指标进行定量质控,不能全面反映该药物中多组分共同作用起效的特点,本实验以栀子金花丸处方中的主要成分栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚10个测定成分作为栀子、金银花、黄芩、知母、黄柏、黄连、大黄7个中药材法定质量评价指标。通过方法学的研究,建立了栀子金花丸中栀子苷、绿原酸等10个活性成分的测定指标。
3.2 色谱柱和流动相的选择本实验分别比较了3种不同品牌不同型号的色谱柱[Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Luna C18(4.6 mm×250 mm,5 µm)]。由3名实验人员,分别采用3种不同色谱柱分别对同一批样品进行测定,测定样品栀子苷含量的RSD(n=9)为1.1%,结果表明Luna C18色谱柱对栀子金花丸水溶性成分的分离效果最佳。
其次本试验测定指标为生物碱盐、有机酸和苷类,故分别对流动相中的酸(磷酸、甲酸、醋酸)进行了考察,将流动相体系的pH由低到高调节至不同值进行分析,最终确定采用0.2%醋酸(pH约3)酸度较为适宜,故选择乙腈-0.2%醋酸溶液作为流动相。
3.3 DAD检测波长的选择栀子金花丸中栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚的紫外吸收波长差异较大[1],栀子苷在238 nm,大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚在254 nm,黄芩苷、黄柏碱在280 nm,绿原酸和小檗碱在345 nm有强吸收,为使这些成分在一次进样中同时得到测定,本研究综合考虑,利用DAD检测器进行全波长扫描后,设定258、280和345 nm 3个检测通道,有效地分离并定量了栀子金花丸中的10个成分,经方法学考察,证实了该方法的准确性与可靠性,从而为栀子金花丸更全面的质量评价和控制提供了参考。
3.4 小结含量测定结果表明,栀子苷、绿原酸、黄芩苷、芒果苷、小檗碱、黄柏碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚10个成分为不同批次栀子金花丸,栀子苷含量均符合《中国药典》2015年版一部该品种项下规定(不得低于2.0 mg·g-1),5批次样品的HPLC色谱行为相似度较高,各批次样品间待测成分含量差异较小,说明栀子金花丸的药材来源和生产工艺均较为稳定。
本研究采用3个不同波长切换,一种色谱条件和系统适用性试验,同时测定,有良好的分离效果,样品提取方法简便,可作为该产品质量考察和控制的参考。
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