2020, Vol. 40 
2. 中国科学院长春应用化学研究所, 长春质谱中心, 长春 130022
2. Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun Mass Spectrometry Center, Changchun 130022, China
马钱子药用历史比较悠久，始载于《本草纲目》，有通络止痛功能，为中医临床经常使用的中药。马钱子中主要含有生物碱成分，目前已经分离出的生物碱化合物有几十种，含量较高的为番木鳖碱（也称士的宁，strychnine）和马钱子碱（brucine），番木鳖碱和马钱子碱又是马钱子的主要活性成分。马钱子中还含有少量的番木鳖碱氮氧化物（strychnine N-oxide）、马钱子碱氮氧化物（brucine N-oxide）、异番木鳖碱（isostrychnine）、奴弗新（novacine）、伪番木鳖碱（pseustrychnine）、16-羟基-α-可鲁勃林（16-OH-α-colubrine）和4-羟基依卡精（4-OH-vomicine）[1-2]等微量生物碱。研究表明，马钱子中微量生物碱也具有十分重要的生物活性[3-4]。电喷雾质谱（ESI-MS）为“软电离”质谱技术，具有专属性强，灵敏度高和样品消耗小的特点，适合于混合物分析，已广泛应用于中药复杂体系的研究[5-7]。近年有文献[8-9]应用液质联用（HPLC-ESI-MS）技术检测了马钱子中番木鳖碱和马钱子碱。生物碱在电喷雾质谱中有较大的响应值，且在电喷雾质谱中多以[M+H]准分子离子形式存在。本文作者也曾应用ESI-MS和ESI-FTICR-MSn技术对中药马钱子炮制前后生物碱的变化进行了研究[10]，由于番木鳖碱和马钱子碱在马钱子总生物碱中含量较高，微量生物碱很难在总生物碱提取物中被检出。本文应用硅胶柱色谱分离技术，初步分离了马钱子总生物碱，通过ESI-MS/MS技术对得到的分离流份中马钱子微量生物碱异番木鳖碱、16-羟基-α-可鲁勃林的结构进行了分析鉴别，研究了异番木鳖碱与番木鳖碱、16-羟基-α-可鲁勃林与4-羟基依卡精等异构体质谱碎裂规律与结构之间的关系，在此基础上建立了区分马钱子中生物碱同分异构体异番木鳖碱与番木鳖碱、16-羟基-α-可鲁勃林与4-羟基依卡精的简便、快速、灵敏的新方法。
1 仪器与试药 1.1 仪器LCQTM离子阱质谱议（Finnigan MAT公司），电喷雾离子源（ESI）和离子阱质量分析器（IT）。
1.2 试药马钱子购于长春市药材公司，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子；硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；所用试剂均为分析纯；士的宁（番木鳖碱）对照品（批号110705-200306，中国食品药品检定研究院）。
2 方法与结果 2.1 质谱条件喷雾电压5.0 kV，金属毛细管温度200 ℃，氮气为壳气，碰撞气为He，源内离子阱内MS2的碰撞能量为20%。正离子模式下进行。质量范围为m/z 50~2 000，实验前质量数均经过校正。流动注射泵进样，进样量3 μL·min-1。
2.2 样品制备 2.2.1 马钱子总生物碱按文献[11]提取。
2.2.2 洗脱流份将马钱子总生物碱提取物加到6 dm×120 dm的硅胶色谱柱上，用正己烷-三氯甲烷-二乙胺（5：4：0.3）和（5：5：0.3）进行梯度洗脱，流份在硅胶G薄层板点样，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-二乙胺（30：16：8：1.5）及甲醇-水（3：1）展开剂系统展开，合并相同流份，得到R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7 7个洗脱流份。
2.3 结果与讨论7个洗脱流份（R1~R7）的电喷雾一级质谱分析结果表明，R1和R2洗脱流份中主要含有番木鳖碱和马钱子碱，未见其他微量生物碱峰（图略）；在R5和R6洗脱流份中，鉴定了另一种微量生物碱伪番木鳖碱[12]；本实验主要对R7洗脱流份进行电喷雾质谱分析。
2.3.1 微量生物碱16-羟基-α-可鲁勃林的电喷雾质谱研究图 1为R7洗脱流份的电喷雾全扫描质谱图，可以观察到m/z 381峰。由于马钱生物碱在电喷雾质谱条件下形成质子化分子，因此，推断m/z 381峰所代表生物碱的相对分子质量为380。由于此峰所代表的生物碱在总生物碱中含量很低，所以在马钱子总生物碱粗提物的电喷雾全扫描质谱中并未检出[10]。
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图 1 R7洗脱流份的电喷雾全扫描质谱图 Fig.1 Electrospray full-scan mass spectrum of R7 elution fraction |
根据文献[2, 13]可知，马钱子中存在2种相对分子质量为380的生物碱，分别为16-羟基-α-可鲁勃林和4-羟基依卡精。16-羟基-α-可鲁勃林与马钱子中番木鳖碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱等生物碱具有类似的骨架结构，属于马钱型生物碱，而4-羟基依卡精为依卡精型生物碱（具有氮桥，氮原子上具有甲基取代）。2种生物碱的结构如图 2所示。为鉴定和归属m/z 381离子，对其进行了电喷雾二级串联质谱研究。
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图 2 16-羟基-α-可鲁勃林（Ⅰ）和4-羟基依卡精（Ⅱ）的结构 Fig.2 Structure of 16-OH-α-colubrine(Ⅰ)and 4-OH-vomicine(Ⅱ) |
从m/z 381离子的MS2质谱图（图 3）可观察到6个主要的碎片离子，即m/z 363、350、338、324、320和306离子。
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图 3 R7洗脱流份中m/z 381离子的ESI-MS2质谱图 Fig.3 ESI-MS2 mass spectrometry of m/z 381 ions in R7 elution fraction |
离子m/z 363是母离子（m/z 381）丢失质量数18生成的，对应H2O分子的丢失，生物碱Ⅰ和Ⅱ分子中均存在1个取代羟基，所以都可以形成丢失H2O分子的子离子。离子m/z 350是母离子（m/z 381）失去质量数31形成的，离子m/z 350的生成提示生物碱分子中存在·OCH3取代基。本实验前期对番木鳖碱和马钱子碱等马钱型生物碱的质谱碎裂规律的研究[14]证明，甲基或甲氧基碎片离子的产生是具有甲氧基取代基的马钱型生物碱的特征丢失，所以可初步推测R7洗脱流份中的m/z 381峰可能代表生物碱Ⅰ。离子m/z 338可能是丢失部分含氮杂环C2H5N（m/z 43）分子形成，离子m/z 324可能是母离子失去整个含氮杂环C3H7N（m/z 57）分子形成，这2种碎裂方式曾出现在马钱型生物碱番木鳖碱氮氧化物的MS3质谱中[14]。离子m/z 320是母离子（m/z 381）丢失61质量数形成，马钱子碱的MS3质谱中也曾出现过这种丢失[14]，对应失去分子中部分七原子含氧环（CH2O）和一分子甲氧基自由基（·OCH3）。m/z 381离子的二级串联质谱数据提示m/z 381离子具有与番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱类似的骨架结构。
根据m/z 381离子的MS2质谱的实验结果，可知该峰所代表的生物碱分子中存在甲氧基取代基，而且与番木鳖碱氮氧化物以及马钱子碱具有类似的骨架结构。因此可推测R7洗脱流份中的m/z 381是16-羟基-α-可鲁勃林所形成的[M+H]+离子。m/z 381离子的MS2质谱的碎裂特点可作为区分16-羟基-α-可鲁勃林与4-羟基依卡精的依据。16-羟基-α-可鲁勃林可能的碎裂机理如图 4所示。
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图 4 m/z 381离子可能的碎裂机理 Fig.4 Possible fragmentation mechanism of m/z 381 ions |
在R7洗脱流份的电喷雾全扫描质谱图（图 1）中，除了可以观察到离子m/z 381外，还可以看到强度较大的m/z 335峰，可以确定该峰代表的生物碱相对分子质量为334。根据文献报道[15]，在马钱子中存在2种相对分子质量为334的生物碱，分别为番木鳖碱和异番木鳖碱，两者互为同分异构体，结构如图 5所示。R7洗脱流份中m/z 335峰究竟表示何种生物碱，电喷雾一级质谱还无法确认。
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图 5 番木鳖碱（a）和异番木鳖碱（b）的结构 Fig.5 Structure of strychnine(a)and isostrychnine(b) |
为进一步对R7洗脱流份中的m/z 335峰所代表的生物碱进行归属和确认，对m/z 335离子进行了二级串联质谱分析（图 6-a），并与番木鳖碱对照品的MS2质谱（图 6-b）进行比较。比较图 6-a、b图，可以看出都出现m/z 307、290、264子离子，但在图 6-a即R7洗脱流份的m/z 335离子的MS2质谱图中，还可以观察到m/z 317离子，m/z 317离子是母离子（m/z 335）丢失H2O（m/z 18）分子形成的。根据m/z 317离子的形成，可以推测R7洗脱流份中的m/z 335离子是异番木鳖碱形成的[M+H]+离子。
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图 6 R7洗脱流份中m/z 335离子（a）和番木鳖碱（b）的MS2质谱图 Fig.6 MS2 mass spectrometry of m/z 335 ions(a)in R7 elution fraction and strychnine(b) |
异番木鳖碱与番木鳖碱具有相同的骨架，由番木鳖碱的12位碳原子连接的醚键开环形成，开环后23位碳原子上连接1个羟基，该羟基在二级质谱中容易形成水分子而失去。因此，R7洗脱流份的m/z 335离子的碎裂特征与异番木鳖碱的结构是相符的，可以推测R7洗脱流份的m/z 335离子应该是异番木鳖碱形成的[M+H]+离子。根据2种生物碱的MS2谱的碎裂特点可以将2种异构体加以区分，这些碎裂规律可以作为鉴定马钱子中番木鳖碱与异番木鳖碱同分异构体的指纹图谱。图 7是异番木鳖碱MS2谱的可能碎裂机理。
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图 7 异番木鳖碱可能的碎裂机理 Fig.7 Possible fragmentation mechanism of isostrychnine |
本文通过色谱分离技术和电喷雾多级串联质谱（ESI-MSn）技术研究了马钱子中一些微量生物碱类化合物的电喷雾质谱行为。以本实验对马钱生物碱特征质谱碎裂特点的研究为基础，简便快捷地区分了结构类似的微量马钱生物碱及其同分异构体，充分发挥了串联质谱在混合物分析中具有的独特优势，为马钱生物碱类化合物的快速、灵敏的分析方法的建立鉴定提供了重要的依据。
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