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  药物分析杂志   2020, Vol. 40 Issue (1): 48-51.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2020.01.07
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基因治疗制品质量分析专栏

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李永红, 韩春梅, 毕华, 陶磊, 李响, 饶春明. SEC-HPLC法测定溶瘤腺病毒注射液的纯度[J]. 药物分析杂志, 2020, 40(1): 48-51. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2020.01.07.
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LI Yong-hong, HAN Chun-mei, BI Hua, TAO Lei, LI Xiang, RAO Chun-ming. Purity determination of oncolytic adenovirus injection by SEC-HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2020, 40(1): 48-51. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2020.01.07.
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基金项目

国家科技重大专项课题资助项目(2018ZX09733002-005)

第一作者

李永红, Tel:(010)67095684;E-mail:scbjlyh@sohu.com;
韩春梅, Tel:(010)67095604;E-mail:hancm@nifdc.org.cn

通信作者

饶春明, Tel:(010)67095380;E-mail:raocm@nifdc.org.cn

文章历史

收稿日期:2019-11-19
SEC-HPLC法测定溶瘤腺病毒注射液的纯度
李永红 , 韩春梅 , 毕华 , 陶磊 , 李响 , 饶春明     
中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室, 北京 100050
摘要目的:建立检测溶瘤腺病毒注射液纯度的分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用XBridge BEH SEC分析柱和Waters 2695/2489高效液相色谱系统,以含150 mol·L-1氯化钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)为流动相进行等度洗脱,流速0.5 mL·min-1,检测波长260 nm,采用峰面积归一法检测溶瘤腺病毒注射液纯度,并对方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、检测下限和定量下限等指标进行考察。结果:空白溶剂无干扰峰出现;未经纯化和热处理的溶瘤腺病毒溶液中溶瘤腺病毒峰与其他杂质峰分离度均大于2.0;溶瘤腺病毒的进样量在2×108~2×1010病毒颗粒(VP)范围内,浓度与吸收峰的线性关系良好(R2=0.998 5);6次进样测得的峰面积的RSD为0.78%;中间精密度试验的RSD为4.7%;检测下限为2.3×106 VP,定量下限为6.7×106 VP。3批溶瘤腺病毒注射液的纯度分析结果分别为99.84%、99.80%、99.64%。结论:SEC-HPLC法可用于检测溶瘤腺病毒注射液的纯度。
关键词溶瘤腺病毒    基因治疗产品    质量控制    纯度    分子排阻高效液相色谱法    
Purity determination of oncolytic adenovirus injection by SEC-HPLC
LI Yong-hong, HAN Chun-mei, BI Hua, TAO Lei, LI Xiang, RAO Chun-ming    
National Institutes of Food and Drug Control, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, Beijing 100050, China
Abstract: Objective: To develop an assay for the purity determination of oncolytic adenovirus injection by SEC-HPLC.Methods: An SEC-HPLC method was used to determine the purity of oncolytic adenovirus injection with XBridge BEH SEC column and HPLC system(Waters 2695/2489). The phosphate buffer solution(pH 7.0) containing 150 mol·L-1 sodium chloride was used as mobile phase for isocratic elution. The flow rate was 0.5 mL·min-1, and the detection wavelength was 260 nm. The purity of oncolytic adenovirus injection was determined by peak area normalization method. The assay was subsequently validated for its specificity, linearity, repeatability, intermediate precision, limit of detection(LOD) and limit of quantitation (LOQ).Results: There was no interference peak in the blank solvent; the resolution between the peak of oncolytic adenovirus and other impurities in the unpurified and heat-treated oncolytic adenovirus solution was greater than 2.0;the linear relationship between the concentration and the absorption peak was good in the range of 2×108-2×1010 viral particle(VP), with R2 being 0.998 5;peak area RSD of six injections was 0.78%;RSD of intermediate precision was 4.7%;the LOD was 2.3×106 VP, and the LOQ was 6.7×106 VP. The purity analysis results of three batches of oncolytic adenovirus injections were 99.84%, 99.80%, and 99.64%, respectively.Conclusion: The SEC-HPLC assay can be applied to determine the purity of oncolytic adenovirus injection.
Keywords: oncolytic adenovirus    gene therapy products    quality control    purity    SEC-HPLC    

人腺病毒(human adenovirus,HAdV)属于哺乳动物腺病毒属,是一种直径为70~90 nm的无包膜病毒,具有二十面体衣壳,由3种主要和4种次要衣壳蛋白组成,衣壳内包含约4.7 kb的线状双链DNA分子[1]。溶瘤腺病毒是对腺病毒的基因组进行工程化改造后,使其在癌组织中选择性复制,导致癌细胞裂解和子代病毒的释放[2-3]。2005年,第1种转基因溶瘤腺病毒Oncorine(H101)被国家食品药品监督管理局批准用于治疗头颈部鳞状细胞癌[4-5]。目前国内外有众多研发单位正在对腺病毒基因组进行更多方式的改造,未来将推动更多的溶瘤腺病毒产品从实验室研究进入到临床应用,以治疗胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和肺癌等多种恶性肿瘤[6-7]。溶瘤腺病毒在作为药品进行生产和研发的过程中,需要采用纯度检测方法对产品质量进行分析和控制[8-9]。分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)作为测定生物大分子纯度的方法,具有操作简单,重复性好,灵敏度高等特点,目前已用于重组肠道病毒71型疫苗[10]、重组戊型肝炎疫苗类病毒颗粒[11]等病毒或病毒样颗粒产品的纯度分析。本文拟建立一种SEC-HPLC方法来检测溶瘤腺病毒注射液的纯度,并进行初步方法学考察。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Alliance 2695型高效液相色谱仪(2489紫外检测仪,Empower 3工作站软件;Waters公司),XBridge BEH SEC色谱柱(7.8 mm×300 mm,3.5 μm,450 Å;Waters公司),AL104型电子天平(Mettler Toledo公司),S220型pH计(Mettler Toledo公司)。

1.2 试药

溶瘤腺病毒注射液为中国食品药品检定研究院重组药物室留存,3批样品批号分别为201808003、201171120和201171208,浓度1.0×1012 VP·mL-1,保存条件为-70 ℃。Tris碱为超纯级,购自Ameresco公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、甘油为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱:Waters XBridge BEH SEC(7.8 mm ×300 mm,3.5 μm,450 Å);流动相:磷酸盐缓冲液1(精密称取十二水磷酸氢二钠7.16 g、二水磷酸二氢钠3.12 g、氯化钠8.76 g,加适量水溶解后用0.1 mol·L-1盐酸或0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至7.0,加水定容至1 L);流速:0.5 mL·min-1;柱温:25 ℃;样品池温度:4 ℃;检测波长:260 nm;进样量:20 μL。

2.2 溶液制备 2.2.1 供试品溶液

取冻存的溶瘤腺病毒注射液室温融化,即得。

2.2.2 空白对照溶液

以溶瘤腺病毒的保存液(精密称取Tris碱2.422 g,氯化钠1.461 g,甘油25 g,加适量水溶解后用0.1 mol·L-1盐酸或0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至8.0,加水定容至1 L)作为空白对照溶液。

2.2.3 未纯化供试品溶液

生产过程中未经纯化的溶瘤腺病毒溶液(由企业提供)。

2.2.4 热处理供试品溶液

将供试品溶液经65 ℃加热20 min。

2.3 专属性和系统适用性

分别取空白对照溶液、供试品溶液、未纯化供试品溶液各20 μL和热处理供试品溶液2 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。结果见图 1,供试品中溶瘤腺病毒峰保留时间在10.50 min,理论塔板数为21 872;空白对照品溶液无干扰峰出现;未纯化供试品和热处理供试品的色谱图中,溶瘤腺病毒峰与其他杂质峰分离度均大于2.0。结果表明本方法的专属性和系统适用性良好。

图 1 空白对照溶液(A)、供试品溶液(B)、未纯化供试品溶液(C)和热处理供试品溶液(D)色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of blank control(A), sample solution(B), unpurified sample solution (C), and heat-treated sample solution(D)
2.4 线性关系考察

将溶瘤腺病毒注射液分别用空白对照溶液稀释至1.02×1010、2.56×1010、6.40×1010、1.60×1011、4.00×1011、1.00×1012 VP·mL-1,混匀,分别进样20 μL,测得各浓度相应的峰面积(表 1),对目标峰面积进行线性评估。以浓度(X)为横坐标,峰面积平均值(Y)为纵坐标作回归分析,得回归方程:

Y=4.82×106X-91 743 R2=0.998 5

表 1 线性试验各浓度样品的峰面积 Tab.1 Peak area of sample at each concentration in linearity test

结果表明溶瘤腺病毒的进样量在2×108~2×1010 VP范围内,线性关系良好(图 2)。

图 2 溶瘤腺病毒的标准曲线 Fig.2 Standard curve of oncolytic adenovirus
2.5 进样精密度及中间精密度试验

取供试品溶液,连续进样6次,测定溶瘤腺病毒的峰面积,结果峰面积的RSD为0.78%,表明本方法的进样精密度良好。连续3 d取供试品溶液,每天分别进样3次,测定溶瘤腺病毒的峰面积,结果峰面积的RSD为4.7%,表明本方法的中间精密度良好。

2.6 检测下限和定量下限

取供试品溶液适量,用空白对照溶液逐步稀释成不同浓度,在上述色谱条件下,分别进样20 μL,按信噪比S/N=3测定其检测下限,按信噪比S/N=10测定其定量下限。结果溶瘤腺病毒的检测下限为2.3×106 VP,定量下限为6.7×106 VP,可以满足测定要求。

2.7 样品测定

取3批溶瘤腺病毒注射液,在上述色谱条件下,分别进样20 μL,每批样品重复进样2次,采用峰面积归一法分析样品纯度,结果批号为201808003、201171120和201171208的样品纯度(n=2)分别为99.84%、99.80%、99.64%。

3 讨论

SEC-HPLC是测定重组蛋白药物纯度常用的方法,但对于溶瘤腺病毒产品来说,由于腺病毒颗粒含有共约2 500个蛋白质分子和约36 000个碱基对的双链DNA分子[12],其相对分子质量远大于单个蛋白质分子,因此给其液相色谱分析带来了挑战。目前通常采用基于电荷分离的阴离子交换HPLC法[13-15]分析腺病毒,尚未见到基于分子大小原理分离的分子SEC-HPLC分析方法的报道。由于产品纯度的检测结果通常是依赖于方法的,采用不同原理的方法互补进行纯度分析将能更好地控制产品的质量。本文采用的XBridge Protein BEH SEC色谱柱以450 Å孔径和3.5 μm大小的颗粒填充,采用亚乙基桥杂化颗粒(BEH)和稳定的二醇基键合技术,与传统100%硅胶基质SEC产品相比性能更佳。建立的SEC-HPLC法在分析未纯化和65 ℃热处理的溶瘤腺病毒时,溶瘤腺病毒峰与杂质峰实现了良好的分离。未纯化样品中杂质峰的保留时间约在18~26 min范围内,而65 ℃热处理的溶瘤腺病毒样品中杂质峰保留时间为19.5 min,均远大于与溶瘤腺病毒峰10.5 min的保留时间。未纯化样品中的杂质主要是来源于病毒宿主细胞的蛋白质和核酸等成分,而65 ℃热处理后病毒样品的杂质主要是病毒因高温裂解释放出的病毒成分,这些杂质的相对分子质量均远小于完整病毒颗粒的相对分子质量,因而得到良好分离。因此,该方法能较好地分析溶瘤腺病毒注射液在生产过程或高温条件下可能产生的这些杂质,可用于测定产品的纯度。需要指出的是,样品在37 ℃温育不同时间处理后形成的聚集体很快结成更大的微米级团块,由于体积过大,难以在SEC-HPLC中检出,可以改用动态光散射法检测。

方法学考察结果表明,线性、进样精密度和中间精密度良好,检测下限和定量下限满足检测要求。总之,建立的SEC-HPLC法可用于检测溶瘤腺病毒注射液的纯度。

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