人腺病毒(human adenovirus,HAdV)属于哺乳动物腺病毒属,是一种直径为70~90 nm的无包膜病毒,具有二十面体衣壳,由3种主要和4种次要衣壳蛋白组成,衣壳内包含约4.7 kb的线状双链DNA分子[1]。溶瘤腺病毒是对腺病毒的基因组进行工程化改造后,使其在癌组织中选择性复制,导致癌细胞裂解和子代病毒的释放[2-3]。2005年,第1种转基因溶瘤腺病毒Oncorine(H101)被国家食品药品监督管理局批准用于治疗头颈部鳞状细胞癌[4-5]。目前国内外有众多研发单位正在对腺病毒基因组进行更多方式的改造,未来将推动更多的溶瘤腺病毒产品从实验室研究进入到临床应用,以治疗胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和肺癌等多种恶性肿瘤[6-7]。溶瘤腺病毒在作为药品进行生产和研发的过程中,需要采用纯度检测方法对产品质量进行分析和控制[8-9]。分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)作为测定生物大分子纯度的方法,具有操作简单,重复性好,灵敏度高等特点,目前已用于重组肠道病毒71型疫苗[10]、重组戊型肝炎疫苗类病毒颗粒[11]等病毒或病毒样颗粒产品的纯度分析。本文拟建立一种SEC-HPLC方法来检测溶瘤腺病毒注射液的纯度,并进行初步方法学考察。
1 仪器与试药 1.1 仪器Alliance 2695型高效液相色谱仪(2489紫外检测仪,Empower 3工作站软件;Waters公司),XBridge BEH SEC色谱柱(7.8 mm×300 mm,3.5 μm,450 Å;Waters公司),AL104型电子天平(Mettler Toledo公司),S220型pH计(Mettler Toledo公司)。
1.2 试药溶瘤腺病毒注射液为中国食品药品检定研究院重组药物室留存,3批样品批号分别为201808003、201171120和201171208,浓度1.0×1012 VP·mL-1,保存条件为-70 ℃。Tris碱为超纯级,购自Ameresco公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、甘油为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱:Waters XBridge BEH SEC(7.8 mm ×300 mm,3.5 μm,450 Å);流动相:磷酸盐缓冲液1(精密称取十二水磷酸氢二钠7.16 g、二水磷酸二氢钠3.12 g、氯化钠8.76 g,加适量水溶解后用0.1 mol·L-1盐酸或0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至7.0,加水定容至1 L);流速:0.5 mL·min-1;柱温:25 ℃;样品池温度:4 ℃;检测波长:260 nm;进样量:20 μL。
2.2 溶液制备 2.2.1 供试品溶液取冻存的溶瘤腺病毒注射液室温融化,即得。
2.2.2 空白对照溶液以溶瘤腺病毒的保存液(精密称取Tris碱2.422 g,氯化钠1.461 g,甘油25 g,加适量水溶解后用0.1 mol·L-1盐酸或0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至8.0,加水定容至1 L)作为空白对照溶液。
2.2.3 未纯化供试品溶液生产过程中未经纯化的溶瘤腺病毒溶液(由企业提供)。
2.2.4 热处理供试品溶液将供试品溶液经65 ℃加热20 min。
2.3 专属性和系统适用性分别取空白对照溶液、供试品溶液、未纯化供试品溶液各20 μL和热处理供试品溶液2 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。结果见图 1,供试品中溶瘤腺病毒峰保留时间在10.50 min,理论塔板数为21 872;空白对照品溶液无干扰峰出现;未纯化供试品和热处理供试品的色谱图中,溶瘤腺病毒峰与其他杂质峰分离度均大于2.0。结果表明本方法的专属性和系统适用性良好。
将溶瘤腺病毒注射液分别用空白对照溶液稀释至1.02×1010、2.56×1010、6.40×1010、1.60×1011、4.00×1011、1.00×1012 VP·mL-1,混匀,分别进样20 μL,测得各浓度相应的峰面积(表 1),对目标峰面积进行线性评估。以浓度(X)为横坐标,峰面积平均值(Y)为纵坐标作回归分析,得回归方程:
Y=4.82×106X-91 743 R2=0.998 5
结果表明溶瘤腺病毒的进样量在2×108~2×1010 VP范围内,线性关系良好(图 2)。
取供试品溶液,连续进样6次,测定溶瘤腺病毒的峰面积,结果峰面积的RSD为0.78%,表明本方法的进样精密度良好。连续3 d取供试品溶液,每天分别进样3次,测定溶瘤腺病毒的峰面积,结果峰面积的RSD为4.7%,表明本方法的中间精密度良好。
2.6 检测下限和定量下限取供试品溶液适量,用空白对照溶液逐步稀释成不同浓度,在上述色谱条件下,分别进样20 μL,按信噪比S/N=3测定其检测下限,按信噪比S/N=10测定其定量下限。结果溶瘤腺病毒的检测下限为2.3×106 VP,定量下限为6.7×106 VP,可以满足测定要求。
2.7 样品测定取3批溶瘤腺病毒注射液,在上述色谱条件下,分别进样20 μL,每批样品重复进样2次,采用峰面积归一法分析样品纯度,结果批号为201808003、201171120和201171208的样品纯度(n=2)分别为99.84%、99.80%、99.64%。
3 讨论SEC-HPLC是测定重组蛋白药物纯度常用的方法,但对于溶瘤腺病毒产品来说,由于腺病毒颗粒含有共约2 500个蛋白质分子和约36 000个碱基对的双链DNA分子[12],其相对分子质量远大于单个蛋白质分子,因此给其液相色谱分析带来了挑战。目前通常采用基于电荷分离的阴离子交换HPLC法[13-15]分析腺病毒,尚未见到基于分子大小原理分离的分子SEC-HPLC分析方法的报道。由于产品纯度的检测结果通常是依赖于方法的,采用不同原理的方法互补进行纯度分析将能更好地控制产品的质量。本文采用的XBridge Protein BEH SEC色谱柱以450 Å孔径和3.5 μm大小的颗粒填充,采用亚乙基桥杂化颗粒(BEH)和稳定的二醇基键合技术,与传统100%硅胶基质SEC产品相比性能更佳。建立的SEC-HPLC法在分析未纯化和65 ℃热处理的溶瘤腺病毒时,溶瘤腺病毒峰与杂质峰实现了良好的分离。未纯化样品中杂质峰的保留时间约在18~26 min范围内,而65 ℃热处理的溶瘤腺病毒样品中杂质峰保留时间为19.5 min,均远大于与溶瘤腺病毒峰10.5 min的保留时间。未纯化样品中的杂质主要是来源于病毒宿主细胞的蛋白质和核酸等成分,而65 ℃热处理后病毒样品的杂质主要是病毒因高温裂解释放出的病毒成分,这些杂质的相对分子质量均远小于完整病毒颗粒的相对分子质量,因而得到良好分离。因此,该方法能较好地分析溶瘤腺病毒注射液在生产过程或高温条件下可能产生的这些杂质,可用于测定产品的纯度。需要指出的是,样品在37 ℃温育不同时间处理后形成的聚集体很快结成更大的微米级团块,由于体积过大,难以在SEC-HPLC中检出,可以改用动态光散射法检测。
方法学考察结果表明,线性、进样精密度和中间精密度良好,检测下限和定量下限满足检测要求。总之,建立的SEC-HPLC法可用于检测溶瘤腺病毒注射液的纯度。
[1] |
BAKER AT, AGUIRRE-HERNáNDEZ C, HALLDéN G, et al. Designer oncolytic adenovirus:coming of age[J]. Cancers, 2018, 10(6): 201. DOI:10.3390/cancers10060201 |
[2] |
GORADEL NH, MOHAJEL N, MALEKSHAHI ZV, et al. Oncolytic adenovirus:a tool for cancer therapy in combination with other therapeutic approaches[J]. J Cell Physiol, 2019, 234(6): 8636. DOI:10.1002/jcp.27850 |
[3] |
CERVERA-CARRASCON V, HAVUNEN R, HEMMINKI A. Oncolytic adenoviruses:a game changer approach in the battle between cancer and the immune system[J]. Expert Opin Biol Ther, 2019, 19(5): 443. DOI:10.1080/14712598.2019.1595582 |
[4] |
GARBER K. China approves world's first oncolytic virus therapy for cancer treatment[J]. J Natl Cancer Inst, 2006, 98(5): 298. DOI:10.1093/jnci/djj111 |
[5] |
LIANG M. Oncorine, the world first oncolytic virus medicine and its update in China[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2018, 18(2): 171. |
[6] |
ROSEWELL SHAW A, SUZUKI M. Recent advances in oncolytic adenovirus therapies for cancer[J]. Curr Opin Virol, 2016, 21: 9. DOI:10.1016/j.coviro.2016.06.009 |
[7] |
NIEMANN J, KüHNEL F. Oncolytic viruses:adenoviruses[J]. Virus Genes, 2017, 53(5): 700. DOI:10.1007/s11262-017-1488-1 |
[8] |
李永红, 毕华, 史新昌, 等. 人用基因治疗制品生产和质量控制的通用性技术要求[J]. 中国新药杂志, 2018, 27(21): 2482. LI YH, BI H, SHI XC, et al. General technical requirements for production and quality control of human gene therapy products[J]. Chin J New Drugs, 2018, 27(21): 2482. |
[9] |
王军志. 生物技术药物研究开发和质量控制[M]. 第3版. 北京: 科学出版社, 2018. WANG JZ. Research, Development and Quality Control of Biopharmaceuticals[M]. 3rd Ed. Beijing: Science Press, 2018. |
[10] |
张改梅, 陈磊, 李国顺, 等. 测定重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)原液纯度的高效分子排阻色谱法的建立及方法的验证[J]. 中国生物制品学杂志, 2019, 32(2): 207. ZHANG GM, CHEN L, LI GS, et al. Development and validation of high performance size exclusion chromatography for determination of purity of bulk of recombinant enterovirus 71 vaccine(Hansenula)[J]. Chin J Biol, 2019, 32(2): 207. |
[11] |
吴清胜, 李媛媛. 重组戊型肝炎疫苗类病毒颗粒纯度高效分子排阻色谱检测方法的建立、验证及应用[J]. 中国生物制品学杂志, 2018, 31(12): 1367. WU QS, LI YY. Validation and application of purity test method for recombinant hepatitis E vaccine virus particles by SEC-HPLC[J]. Chin J Biol, 2018, 31(12): 1367. |
[12] |
CHELIUS D, HüHMER AF, SHIEH CH, et al. Analysis of the adenovirus type 5 proteome by liquid chromatography and tandem mass spectrometry methods[J]. J Proteome Res, 2002, 1(6): 501. DOI:10.1021/pr025528c |
[13] |
BLANCHE F, CAMERON B, BARBOT A, et al. An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenoviral particles[J]. Gene Ther, 2000, 7(12): 1055. DOI:10.1038/sj.gt.3301190 |
[14] |
WHITFIELD RJ, BATTOM SE, BARUT M, et al. Rapid high-performance liquid chromatographic analysis of adenovirus type 5 particles with a prototype anion-exchange analytical monolith column[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216(13): 2725. DOI:10.1016/j.chroma.2008.11.010 |
[15] |
KUHN I, LARSEN B, GROSS C, et al. High-performance liquid chromatography method for rapid assessment of viral particle number in crude adenoviral lysates of mixed serotype[J]. Gene Ther, 2007, 14(2): 180. DOI:10.1038/sj.gt.3302851 |