人血白蛋白（human albumin）系由健康人血浆分离纯化并经病毒灭活后制成的注射剂，临床应用广泛。白蛋白纯度是指制品中白蛋白主成分占所有蛋白成分的比例。目前国内生产厂家均采用低温乙醇沉淀法纯化白蛋白，通过调节蛋白浓度、pH、离子强度、温度与乙醇浓度等参数，最终使白蛋白分离纯化^[1]。纯度是关键项目，然而，该工艺无法将理化性质与白蛋白相近的蛋白质完全去除，因此产品中不可避免存在一定量的杂蛋白^[2-3]，影响产品纯度这一质量属性。

《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版采用醋酸纤维素薄膜电泳法测定白蛋白纯度^[4]，国内批签发机构及生产企业均采用意大利Interlab公司全自动醋酸纤维素薄膜电泳仪测定白蛋白纯度，然而该仪器目前已停产，试剂申购及仪器维修面临很大困难，给该产品及免疫球蛋白制品的检测带来诸多不便，因此急需建立其他纯度测定方法。欧洲药典同时收载了醋酸纤维素薄膜电泳法和琼脂糖凝胶电泳法^[5]，但试验条件未详细说明，仅提及按照仪器生产商的指导说明进行试验。

《中国药典》2015年版附录收载琼脂糖凝胶电泳法，但规定本法适用于核酸、蛋白复合物的分离。载琼脂糖凝胶电泳法也见于临床血清蛋白的测定^[6-12]。本研究参考药典附录0541第三法建立人血白蛋白琼脂糖凝胶电泳法，对国内外153批白蛋白样品进行测定，并与醋酸纤维素薄膜法进行比较。

1 仪器与试药

Epalyzer 2型全自动电泳仪及其配套的电泳试剂盒（Helana公司），包括琼脂糖预制凝胶（批号0180），染色液（0.35%酸性蓝，批号11478052）和染色液（2%醋酸溶液，批号1711251，西陇科学股份有限公司）。

人血白蛋白质控品（纯度97.2%，企业自制，按醋酸纤维素薄膜法——《中国药典》2015年版四部通则第二法标定），国内外33家企业的人血白蛋白样品，共153批。按照企业顺序依次以1~153作为样品编号。

2 方法与结果 2.1 供试品溶液制备

取人血白蛋白样品100 µL，加纯化水900 µL，稀释成蛋白浓度为2%的溶液，即得。

2.2 电泳条件

电压：240 V，时间：8 min；染色：15 min，脱色：6 min；干燥时间：6 min。

2.3 操作

取供试品溶液50 µL，依次加入样品盘内，加样完成后将样品盘置于仪器相应的位置上。电泳结束后，对电泳谱图进行扫描，分析结果数据。

2.4 系统适用性考察

取正常人质控血浆50 µL，在染色液浓度0.35%，体积800 µL的条件下考察琼脂糖凝胶电泳法分离测定血浆蛋白的性能。结果见图 1所示，血浆中各蛋白能够很好地分离，其含量在规定的区间范围内，表明该仪器能够很好地分离血浆蛋白。

2.5 定量测定区间

将白蛋白质控品用纯化水稀释成浓度为10%、7.5%、5%、4%、3%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%、0.1%的溶液，取该溶液50 µL，在染色液浓度为0.35%，体积为800 µL时照“2.2”项下条件检测。结果见表 1，蛋白浓度在1%~5%之间，纯度测定结果与质控品纯度接近。而当样品浓度为0.1%时，测定值与质控品的标示值相差较大，且RSD较大。故琼脂糖凝胶电泳法测定白蛋白纯度的定量区间为0.5%~5%，检测下限为0.1%。

2.6 精密度

取“2.5”项下溶液（蛋白浓度2%）50 µL，在染色液浓度为0.35%，体积为800 µL时照“2.2”项下条件检测。由2位分析员分别对同一质控品平行测定10次，结果显示，2位分析员测得的蛋白纯度均为96.5%，RSD分别为0.35%、0.23%，图谱见图 2。结果表明方法精密度良好。

2.7 耐用性 2.7.1 上样体积

点样梳通过表面吸附作用，将白蛋白样品点至琼脂糖凝胶中，比较不同加样量对纯度测定值的影响。在染色液浓度0.35%，染色液体积800 µL条件下，通过加入不同体积“2.5”项下白蛋白质控品溶液（蛋白浓度2%）进行试验，结果见表 2，上样体积对蛋白纯度测定值有显著影响，且体积为50 µL时，RSD最小。

2.7.2 蛋白浓度微小变化对测定结果的影响

按照“2.5”项下方法分别配制蛋白浓度为1.8%、2.0%、2.2%的溶液，在染色液浓度0.35%，染色液体积800 µl条件下，测定蛋白纯度。结果见表 3。

2.8 样品测定

按照“2.1”和“2.2”项下方法制备供试品溶液，并对白蛋白样品纯度进行测定，结果见表 4，蛋白纯度为94.8%~98.8%，平均值为96.7%。而采用《中国药典》2015年版四部通则醋酸纤维素薄膜法进行测定（电泳条件：电压140 V，时间20 min；染色5 min，脱色8 min；透明3 min，干燥10 min；取供试品溶液30 µL，依次加入样品盘内，加样完成后将样品盘放于仪器相应的位置上检测），结果见表 4，蛋白纯度为96.1%~99.0%，平均值为97.1%。2种方法的测定结果相近。经配对t检验统计分析，两者无统计学差异。

3 讨论 3.1 蛋白浓度的选择

验证琼脂糖凝胶电泳法时，发现蛋白浓度和染色液的量影响琼脂糖凝胶电泳的测定结果。蛋白浓度越高，相应的纯度测定值越低，原因是浓度高时，制品中的杂蛋白逐渐显示出来，因此测定值逐渐降低。然而，浓度越高，主成分白蛋白过载的现象开始凸显，因此测定浓度适宜范围为小于7.5%。《中国药典》2015年版四部通则0541第三法“琼脂糖凝胶电泳法”规定：测定蛋白纯度时，应将蛋白浓度稀释至1%~2%的浓度。考虑到浓度越稀时，杂蛋白显示效率越低，因此本文采用2%的蛋白浓度测定样品。

3.2 染色液浓度及体积的选择

另一个影响因素是染色液的量。蛋白质染色深浅对于纯度扫描结果有较大影响，染色过度，脱色液洗脱时存在较大困难，导致背景不清晰，影响结果判定；而染色不足，白蛋白中的杂蛋白又无法正常显示，影响结果的准确度。本文考察不同染色液浓度和体积对质控品测定结果的影响^[13-14]。当染色液浓度为0.35%、0.67%时，染色液体积为400、800 µL时，测定结果无显著差异。然而当染色液体积为400 µL时，浓度为0.35%时，白蛋白染色不完全充分，存在空心现象；而染色液浓度为0.67%时，琼脂糖凝胶电泳膜片偶见脱色不充分现象，基于仪器说明指导及试验结果，选择染色液浓度为0.35%、染色液体积为800 µL的试验条件。

3.3 小结

本法具有操作简便，检测时间短，检测效率高，分辨率更高的特点；与醋酸纤维素薄膜法测定结果比较没有显著性差异（p > 0.05），测定结果可反映不同企业之间的产品杂蛋白数量和含量，反映各企业间产品的质量差异。