2019, Vol. 39 
护肝片作为纯中药复方制剂，由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉和绿豆6味中药组成[1]，具有保护肝损伤、抗氧化、提高免疫等作用[2-6]。护肝片配方中以柴胡为君药，柴胡具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气功效，化学成分主要有皂苷类及黄酮类化合物，其中柴胡皂苷为其主要活性成分之一，该成分具有增强机体特异性免疫反应，抗菌消炎和抗病毒等作用[7-13]。而在2015年版《中华人民共和国药典》质量标准中，仅以五味子醇甲1个成分的含量评价成方的质量，显然不够科学和全面，难以准确评价不同厂家的产品质量以及避免生产过程中添加单一成分以符合质量标准的情况。因此，对护肝片中君药柴胡进行定量研究具有积极的意义。目前，文献报道的关于多个柴胡皂苷同时测定的HPLC定量分析方法大多采用单波长的方法，造成个别柴胡皂苷的紫外吸收比较弱，存在定下量限、检测下限偏高，定量不准确等问题；或者仅仅对2到3个柴胡皂苷进行同时测定，不能全面反映护肝片中柴胡皂苷类成分的量[14-15]。为此，本文建立一种同时测定护肝片中环氧醚型（柴胡皂苷a、c、d）和异环双烯型（柴胡皂苷b1、b2）5个柴胡皂苷成分含量的HPLC分析方法，并采用此方法对市售12个厂家50批次的护肝片进行含量测定。比较各厂家之间及同一厂家不同批次之间的质量差异，为评价和进一步提高护肝片的质量提供科学依据。
1 仪器与试药岛津LC-20AD高效液相色谱仪（DAD二极管阵列检测器）；Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；Millipore Milli-QA超纯水器；Mettler Toledo XS205十万分之一分析天平。
对照品柴胡皂苷a（批号110777-201108，含量93.2%）与柴胡皂苷d（批号110778-201409，含量97.3%）购于中国食品药品检定研究院，对照品柴胡皂苷c（批号C-025-160809，含量99.04%）、柴胡皂苷b1（批号C-085-170417，含量99.43%）、柴胡皂苷b2（批号C-051-170421，含量99.81%）均购于成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
样品来自12家（A~L）生产企业，共50批（S1~S50）。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品储备溶液分别精密称取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2的对照品适量，加甲醇制成各成分对照品母液（柴胡皂苷a 0.336 8 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.326 7 mg·mL-1、柴胡皂苷c 0.378 3 mg·mL-1、柴胡皂苷b1 0.390 4 mg·mL-1、柴胡皂苷b2 0.380 9 mg·mL-1）。精密吸取上述母液各5 mL，置25 mL量瓶中，用50%甲醇水稀释至刻度，即得柴胡皂苷a、d、c、b1和b2的混合对照品储备溶液（质量浓度分别为67.36、65.34、75.66、78.08、76.18 μg·mL-1）。
2.1.2 供试品溶液取各批次护肝片20片（糖衣片除去糖衣）研细，取约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，加入含5%氨水的80%甲醇水溶液50 mL，称量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，称量，用5%氨水的80%甲醇水溶液补足减失的量，经0.45 μm微孔过滤膜过滤，即得。
2.2 色谱条件采用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱（0~40 min，30%~53%乙腈；40~48 min，98%乙腈），检测波长210 nm（柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d）、254 nm（柴胡皂苷b1、b2），流速1 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量为10 μL。理论板数按柴胡皂苷b1峰计算不低于5 000，分离度 > 1.5。混合对照品溶液、供试品溶液色谱图见图 1。
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1.柴胡皂苷c（saikosaponin c）2.柴胡皂苷a（saikosaponin a）3.柴胡皂苷b1（saikosaponin b1）4.柴胡皂苷b2（saikosaponin b2）5.柴胡皂苷d（saikosaponin d） 图 1 柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d对照品（A，C）和样品（B，D）的HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of saikosaponins a, saikosaponins b1, saikosaponins b1, saikosaponins c, saikosaponins d(A, C)and sample(B, D) |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加50%甲醇水稀释定容至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液；精密吸取上述溶液10 μL，在上述色谱条件下分别进行测定，以对照品的进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d及黄芩苷的回归方程、相关系数和线性范围见表 1。
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表 1 各成分线性回归分析 Tab.1 Regression analysis of different components |
取同一混合对照品溶液，按“2.2”项的色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算柴胡皂苷a、b1、b2、c、d峰面积的RSD，分别为0.90%、1.2%、0.35%、0.96%、0.94%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验取同一份供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24、48 h后按“2.2“”项的色谱条件进样测定，结果柴胡皂苷b1、b2峰面积的RSD分别为0.35%、1.12%，说明供试品溶液在配制好后48 h内稳定。
2.6 重复性试验取A企业样品（批号201702088）按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μL进行测定，测得柴胡皂苷b1、b2含量的平均值分别为0.215、0.652 mg·g-1，RSD分别为1.7%、1.6%。结果表明该方法重复性较好。
2.7 加样回收试验取已知含量的护肝片样品（A企业，批号201702088）约0.5 g，精密称定，精密加入0.336 8 mg·mL-1柴胡皂苷a、0.326 7 mg·mL-1柴胡皂苷d、0.378 3 mg·mL-1柴胡皂苷c、0.390 4 mg·mL-1柴胡皂苷b1、0.380 9 mg·mL-1柴胡皂苷b2的对照品溶液各2 mL，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试溶液，在上述色谱条件下进样10 μL分别进行测定，计算回收率，测得样品平均加样回收率分别为101.8%、102.9%、101.7%、99.7%、100.6%，RSD分别为1.9%、2.0%、1.5%、1.8%、1.7%。
2.8 样品测定精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液10 μL及供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件分别进样测定，以外标法计算含量，结果见表 2。
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表 2 50批样品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的含量测定（mg·g-1，n=3） Tab.2 Contents of saikosaponins a, saikosaponins b1, saikosaponins b2, saikosaponins c, saikosaponins d in fifty batches of samples |
本实验对护肝片中的柴胡皂苷成分进行含量测定，对比了含5%氨水的80%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液以及甲醇溶液，回流与超声2种提取方法对护肝片中的柴胡皂苷类的提取效率，结果表明含5%氨水的80%甲醇水溶液超声提取效率明显高于其他溶剂与方法。在超声时间考察时发现30 min以上时，提取效率基本不变，故选择超声时间为30 min。
3.2 流动相的选择本研究考察了多种流动相系统，最终发现乙腈-水梯度洗脱条件下的色谱峰分离效果好，峰形尖锐，5个柴胡皂苷均具有较好的稳定性、精密度和重复性，在柱温25 ℃条件下，流动相对皂苷稳定性没有影响。
3.3 检测波长的选择采用DAD检测器分别对5个柴胡皂苷混合对照品溶液在200~400 nm波长处进行全扫描，发现柴胡皂苷a、c、d最大吸收波长为210 nm，而柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2在254 nm处有最大吸收。为确保5个柴胡皂苷类成分均能得到很好的响应，综合考虑确定在双波长下同时测定5个柴胡皂苷的含量。
3.4 结果分析通过建立的HPLC-DAD双波长法对12个厂家50批护肝片中5个皂苷类成分的含量进行测定，所有批次的护肝片中均未检测到柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d，除个别厂家外其他厂家生产的护肝片中均检测到了柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2。这可能是由于柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的结构不稳定，中药制剂又大多采用水提取工艺，在生产过程中柴胡中的原生皂苷易发生结构改变，转化为柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2，并且这种转化反应很稳定。
测定结果显示不同厂家样品中柴胡皂苷含量存在显著差异，柴胡皂苷b1最大值可达最小值的24倍，柴胡皂苷b2最大值可达最小值的15倍，柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2的总量上也相差17倍之多，个别厂家生产的护肝片中甚至未检测到柴胡皂苷。除了不同生产企业之间的差异较大外，同企业生产的不同批次间的差异也较大，如F与I企业柴胡皂苷柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2的总量不同批次间相差近3~4倍。可见不同厂家投料的柴胡原药材质量及生产工艺存在巨大差异，最终导致护肝片的质量参差不齐，因此提高和完善护肝片的质量标准十分迫切。
本研究建立了同时测定护肝片中柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的HPLC分析方法。所建立的方法符合定量分析要求，操作简单，结果准确、可靠，重现性好。可为护肝片及含柴胡的中药制剂的定量控制与质量标准的建立提供一定的科学依据。12家生产企业的50批样品的检测数据，可为临床用药的安全、有效提供基础研究资料。
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