鱼肝油是从鳕鱼或鲨鱼等深海鱼肝脏中提取的一种脂肪油，其中富含维生素A^[1-2]。维生素A是一系列包括视黄醇、视黄醛、视黄酸和视黄醇酯等在内的视黄醇衍生物的统称，对细胞分化、胚胎发育、视觉感受等多个生理功能发挥重要作用^[3]。鱼肝油中的维生素A主要以视黄醇高级脂肪酸酯的形式存在^[4]，并包含多种顺反异构体，以全反式构型为主，还包括13-顺式^[5]，9-顺式与9，13-顺式构型^[6]等(图 1)。不同构型的维生素A生物活性不同，全反式最高，13-顺式、9-顺式与9，13-顺式构型的活性分别约为全反式的75%、19%与16%^[7]。美国等国药典^{[2, 8-9]}均按全反式构型计算鱼肝油中维生素A的含量，很可能造成其实际活性低于理论值。因此，建立一个可以分离鉴定鱼肝油中维生素A酯顺反异构体的分析方法对于鱼肝油的质量控制有着重要意义。

目前，用于维生素A分离检测的色谱柱固定相包括硅胶、C₁₈及C₃₀等。其中正相硅胶柱多用于视黄醇异构体的分离^[10-12]。C₁₈柱也常用于维生素A的分析，在此前的研究中，本实验室采用C₁₈柱分离鉴定了3种鱼肝油中共16种维生素A酯^[13]，但C₁₈柱对异构体的分离能力较弱^[12]。C₃₀色谱柱又被称为类胡萝卜素色谱柱(Carotenoid色谱柱)，在类胡萝卜素及其异构体的分离上有独特的优势，原因在于C₃₀键合相的链长大致与胡萝卜素分子的长度相当，增强了两者的相互选择性^[14]。由于维生素A与类胡萝卜素结构相似，也有文献采用C₃₀柱对维生素A做分离，同时分离了5种维生素A酯及对应的α异构体^[15]。由于不同构型维生素A酯的紫外最大吸收波长各不相同，紫外光谱鉴别^[12]也是维生素A构型鉴别的常用方法之一。

本研究采用C₃₀色谱柱，以甲基叔丁基醚-甲醇-水为流动相，结合对照品比对和飞行时间质谱(TOF/MS)法，对2种鱼肝油样品中8种维生素A酯做了分离与结构鉴定，其中包含3组顺反异构体。通过氧化破坏及13-顺式维生素A酯对照品比对等方法对顺式异构体进行研究，结果表明顺式异构体均为13-顺式构型。本方法可为鱼肝油质量控制提供参考依据。

1 材料与方法

LC-20AD高效液相色谱仪(岛津公司)；1290 Infinity液相色谱- 6538Q TOF四极杆飞行时间质谱仪(安捷伦公司)。

鳕鱼肝油胶囊由企业A提供，鲨鱼肝油由企业B提供。甲基叔丁基醚与甲醇为色谱纯，自制纯化水。全反式维生素A醋酸酯(批号100368-201502)购自中国食品药品检定研究院。13-顺式维生素A醋酸酯(批号11-GJF-32-2)、全反式维生素A油酸酯(批号14-THT-179-1)、全反式维生素A棕榈酸酯(批号2-MWC-189-1)与全反式维生素A硬脂酸酯(批号23-CF-173-3)均购自Toronto Research Chemicals。

2 实验条件 2.1 液相色谱条件

采用YMC C₃₀(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为甲醇(A)-水(B)-甲基叔丁基醚(C)，梯度洗脱，见表 1；流速为1.0 mL·min^-1；检测波长328 nm；柱温为40 ℃；进样量为20 μL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾正离子化(ESI⁺)检测，喷雾电压4.0 kV，雾化气压力0.24 MPa，干燥气流量10 L·min^-1，去溶剂温度350 ℃，碎片电压175 V。质量数扫描范围m/z 100~1 000。

2.3 供试品溶液与对照品溶液

取鱼肝油胶囊内容物或鱼肝油约0.5 g，置50 mL量瓶中，加异丙醇适量，超声5 min(360 W，40 kHz)，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。取维生素A酯对照品各约5 mg，分别置100 mL量瓶中，加异丙醇适量，超声5 min(360 W，40 kHz)，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.4 氧化破坏溶液

取全反式维生素A酯对照品约10 mg，置50 mL量瓶中，加碘试液1滴，超声10 min(360 W，40 kHz)，用异丙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为氧化破坏溶液。

3 结果与讨论 3.1 维生素A酯的分离

按照“2.1”项下的条件分别对供试品溶液、对照品溶液与氧化破坏溶液进行分析，结果见图 2、3，表明本试验考察的鳕鱼肝油胶囊含有全反式维生素A棕榈酸酯，鲨鱼肝油含全反式维生素A油酸酯、棕榈酸酯与硬脂酸酯。此外，两者还有多个未知维生素A酯峰，需做进一步鉴定，其中峰2、4、8分别为对应全反式维生素A油酸酯、棕榈酸酯与硬脂酸酯的氧化破坏产物。各色谱峰的紫外最大吸收波长见表 2。

3.2 维生素A酯的质谱鉴定

根据此前建立的质谱分析方法^[13]，首先通过ESI⁺- TOF/MS对全反式维生素A棕榈酸酯对照品做一级质谱分析，结果见图 4。一级质谱中主要产生m/z 269，524与563 3个信号峰，m/z 269为源内裂解脱去棕榈酸的加氢离子(C₂₀H₂₉⁺，质量误差-0.8×10^-6)，为维生素A酯的特征离子，与文献^[15]报道情况一致；m/z 524与563分别为维生素A棕榈酸酯的脱电子离子(C₃₆H₆₀O₂⁺，质量误差1.8×10^-6)与加钾离子(C₃₆H₆₀O₂K⁺，质量误差-1.6×10^-6)。以上质谱特征对于推测未知维生素A酯提供了参考依据。

之后以同样条件对全反式维生素A棕榈酸酯的氧化破坏产物做一级质谱分析，其质谱图与全反式维生素A棕榈酸酯相同，说明氧化破坏产物是全反式维生素A酯的某种异构体。以m/z 269与524为母离子，分别对全反式维生素A棕榈酸酯与其氧化产物做二级质谱分析，结果发现两者二级质谱图均相同，未发现特征子离子，进一步说明氧化产物很可能为某种顺反异构体。

最后用同样的方法对供试品溶液做一级质谱分析，提取每个色谱峰的质谱图，其中均有m/z 269离子，表明色谱图中标注的色谱峰均为维生素A酯峰。并根据分子离子精确分子量，结合维生素A酯的结构特征，如组成元素为C、H、O，O原子数为2，最小不饱和度为7等，推测相应分子式。相关色谱质谱数据，推测分子式、以及推测维生素A酯类型见表 2。峰3、5、9的保留时间、分子式与PDA紫外最大吸收波长分别与全反式维生素A油酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯一致。峰2、4、8的分子式分别与维生素A油酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯一致，PDA紫外最大吸收波长与13-顺式维生素A醋酸酯对照品相同，均为328 nm。而峰6和峰7的分子式分别与维生素A花生烯酸酯与十七烷酸酯相应，紫外最大吸收波长均为325 nm，与全反式维生素A对照品相同，推测为全反式构型。

3.3 顺反异构体的鉴别

根据文献报道，鱼肝油中维生素A以全反式构型为主，13-顺式构型其次^[16]，结合“3.1”、“3.2”项下的色谱光谱质谱信息，推测2种鱼肝油样品中的维生素A酯异构体对应的是13-顺式构型。由于市售13-顺式维生素A酯对照品仅为醋酸酯，无法直接比对，但有文献报道全反式维生素A在加碘氧化破坏条件下会产生13-顺式产物^[17]。因此，本试验将全反式维生素A醋酸酯对照品按“2.4”项条件做氧化破坏，按“2.1”项下条件[流动相改为甲醇-水(85:15)]进行液相分析，将破坏产物与13-顺式维生素A醋酸酯对照品做比对，结果表明两者保留时间一致(图 5)。同时比较PDA图发现(图 6)，全反式与13-顺式维生素A醋酸酯对照品的紫外最大吸收分别为325 nm与328 nm，与文献报道^[12]一致，而氧化破坏产物的最大吸收也为328 nm。综合以上光谱、色谱与质谱信息，推测全反式维生素A酯在“2.4”项条件下的破坏产物为13-顺式构型，与峰2、4、8对应。因此，峰2、4、8分别为13-顺式维生素A油酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯。该异构化反应属于自由基加成反应，反应机理见图 7。

4 结论

本研究采用C₃₀色谱柱，以甲基叔丁基醚-甲醇-水为流动相，对2种鱼肝油样品中的8种维生素A酯做了分离，采用光谱、色谱、质谱等方法对进行定性分析，并通过氧化破坏方法制备13-顺式异构体进行比对。鳕鱼肝油胶囊中主要含有全反式与13-顺式维生素A棕榈酸酯，鲨鱼肝油中主要含有全反式与13-顺式维生素A油酸酯、棕榈酸酯与硬脂酸酯等。按面积归一化法计算，2种样品中13-顺式维生素A分别约占总量的31%与17%，其维生素A的实际活性分别约为理论值的92%与96%，说明了对维生素A异构体检查与控制的必要性，本方法可为鱼肝油质量控制提供参考依据。