2019, Vol. 39 
2. 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室, 呼和浩特 010018;
3. 二连浩特海关技术中心, 二连浩特 011100
2. Key Laboratory of clinical Diag-nosis and Treatment techniques for Animal Disease of Agriculture Ministry, Hohhot 010018, China;
3. Customs Technology Center in Erenhot, Erenhot 011100, China
红霉素(erythromycin，ERM)属大环内酯类抗生素。红霉素常作为人畜共用抗菌药，由于具有较高的口服生物利用率和在多种组织、器官中的细胞内积聚能力，以及对支原体和葡萄球菌、链球菌等多种革兰氏阳性菌的较强的抵抗作用，因而被广泛用于猪、牛、羊及家禽等动物疾病的防治[1]。这种广泛的应用导致了动物源性食品中红霉素的残留，进而通过食物链途径进入人体，对人体健康产生潜在的威胁。欧盟、中国等许多国家和地区已经限制红霉素的使用并规定了可食性动物组织中的最大残留量[2]。由于其代谢时间长，很容易在动物体内造成不必要的残留，无形中就会对人体产生危害[3-7]。
我国农业部235号公告中关于牛/羊奶中红霉素的最高残留限量规定为40 µg·kg-1，牛/羊/猪禽肌肉、脂肪、肝、肾中红霉素的最高残留限量为400µg·kg-1，禽蛋中红霉素的最高残留限量为200 µg·kg-1[8]。有关食品中红霉素残留的测定，主要有液相色谱-荧光法、液相色谱-电化学法和液相色谱-质谱法[9-11]，于慧娟等[12]建立了高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中红霉素的残留，包括鱼，虾，蟹，甲鱼等水产品；周玲等[13]建立高效液相色谱串联质谱检测巢脾中红霉素的残留，包括蜜蜂及蜂产品；林维宣等[14]采用液相色谱串联质谱法检测关于牛乳中多肽类抗生素的残留量；Lopez等[15]建立了蜂蜜中抗生素残留多组分的LC-MS/MS的测定与确证，其中对于大环内酯类抗生素红霉素仅可被检测和确认，而不能被定量；MARTOS等[16]用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法对家禽、肉类中的9个大环内酯类化合物进行了简单的多残基提取和分析方法的分析。国外对牛可食性组织中红霉素的LC-MS/MS检测的相关报道较少，而国内对于牛可食性组织中红霉素LC-MS/MS的残留检测方法目前尚未见有相关报道，故有必要建立一种高效可行的方法，以适应市场需求。其中，传统的液相色谱-质谱法主要是乙腈提取，正己烷去脂，乙腈层用氮气浓缩后过Oasis HLB固相萃取柱，再用甲醇洗脱后氮气吹干，磷酸盐溶液溶解残渣后供液相色谱-串联质谱仪测定。该前处理方法过程烦琐，用时较长，可能的误差较大，且固相萃取柱价格较贵，对实践中大规模的残留检测现实意义不大。本研究建立的试验方法步骤简便，易操作，回收率较高，不需要耗费固相萃取柱，也不需要氮气浓缩，适合大批量牛肉样品的LC-MS/MS检测。本方法的建立，节约了成本和时间，大大提高了检测效率，为牛可食性组织中红霉素残留的常规检测提供了可靠的方法。
1 材料与仪器 1.1 组织样品无红霉素残留的牛肉(肝、肾、肺、肠)样品购买于锡林郭勒盟地区，经绞肉机绞碎匀浆后，放入-80 ℃冷冻保存，测定前室温解冻。
1.2 仪器与试剂Agilent 6460高效液相色谱串联质谱仪(安捷伦公司)；3-30K型离心机(Thermo公司)：转速不小于15 000 r·min-1；MS105DU型分析天平(精度0.000 1 g和0.000 01 g，奥豪斯仪器有限公司)；KQ-700DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
乙腈、正己烷(色谱纯，Sigma公司)；氨水为分析纯。实验用水符合GB/T6682规定要求。对照品红霉素(CAS：59319-72-1，含量大于99%，Sigma公司)、罗红霉素(内标，CAS：80214-83-1，含量不低于90%，Sigma公司)。
2 方法 2.1 样品处理称取牛肉(肝、肾、肺、肠)样品约5 g，加入10 mL乙腈，涡旋振荡10 min，12 000 r·min-1(-10 ℃)下离心5 min，按上述步骤重复操作1次，将上清液合并于50 mL聚丙烯无菌离心管中。先加入正己烷10 mL，涡旋振荡离心，分层后去除上层正己烷，再次重复此步骤1次。取下清液1 mL，用0.22 μm针孔滤器直接过滤到样品瓶中供LC-MS/MS测定。
2.2 色谱条件色谱柱：CAPCELL PAK MGⅡ-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.5%氨水(92:8)，流速：0.5 mL·min-1，保持15 min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；红霉素和罗红霉素的保留时间分别为5.967和8.548 min。
2.3 质谱条件离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：4.0 kV。
离子传输毛细管温度：350 ℃；源内碰撞诱导解离电压：7 V；雾化器流速：8 L·min-1。
2.4 溶液的配制准确称取0.66 mg红霉素于2 mL EP管中，加入乙腈1.32 mL溶解，配制成0.5 mg·mL-1红霉素对照品储备液；准确称取0.77 mg罗红霉素于2 mL EP管中，加入乙腈1.54 mL溶解，配制成0.5 mg·mL-1罗红霉素对照品储备液，于4 ℃保存。将0.5 mg·mL-1罗红霉素对照品储备液用乙腈稀释成50 ng·mL-1的内标溶液。
2.5 线性关系在本方法的实验条件下，取牛肉(肝、肾、肺、肠)样品约5 g，加入质量浓度为50 ng·mL-1内标溶液(用乙腈稀释)1 mL，分别加红霉素对照品1 mL，使其含红霉素分别为0、20、40、80、200、400、800 ng·g-1，按照“2.1”项下方法处理，制成质量浓度分别为0、5、10、20、50、100、200 ng·mL-1的系列对照品牛肉(肝、肾、肺、肠)；以红霉素和罗红霉素的响应峰面积比Y对相应的质量浓度(X，ng·mL-1)进行线性回归，得回归方程见表 1。在5~200 ng·mL-1检测范围内峰面积比值和质量浓度之间有良好的线性关系。
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表 1 牛可食性组织的线性范围、回归方程 Tab.1 Linear range and regression equation of bovine edible tissue |
按照“2.4”项下方法制备系列较低质量浓度0、5、10、20、50、100、200 ng·mL-1的红霉素标准工作溶液和50 ng·mL-1的罗红霉素内标溶液，并将其分别添加到牛肉(肝、肾、肺、肠)空白样品中，按照“2.1”项下方法处理后检测，每个浓度平行测定5次，计算LOD(S/N > 3)和LOQ(S/N > 10)。红霉素的LOD为5 μg·kg-1(S/N > 3)，LOQ为20 μg·kg-1(S/N > 10，RSD < 10%)。
2.7 准确度与精密度考察在牛肉(肝、肾、肺、肠)中添加3个不同浓度(10、50、200 ng·mL-1)的红霉素标准工作溶液，按照“2.1”项下方法进行处理，照本法进行测定，每个浓度测定5次。根据红霉素回归方程计算药物浓度，并与加入值进行比较，计算相对回收率。各浓度在1 d之内测5次；每一浓度隔天测定1次，连续测定5次，计算批内、批间RSD。回收率测定结果如表 2所示，由表 2结果可知，回收率符合LC-MS/MS检测要求，可用于测定牛可食性组织中红霉素浓度。精密度测定结果如表 3所示，高、中、低3个质量浓度的批内精密度RSD均小于9%，批间精密度RSD均小于10%，均符合检测要求。
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表 2 牛可食性组织样品中红霉素的回收率(n=5) Tab.2 Recovery of erythromycin in bovine edible tissue samples |
将0.5 mg·L-1的红霉素对照品储备液在正离子模式下对红霉素进行一级质谱分析，得到一级母离子(m/z 734.4)，对准分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，红霉素的二级质谱图见图 1-A，红霉素的二级质谱碎片主要有m/z 734.4/158.1、m/z 734.4/522.2、m/z 734.4/576.3，选择响应值高和基线噪音低的离子对m/z 734.4/576.3、m/z 734.4/158.1作为定性离子对，选择信号较强和无干扰的m/z 734.4/158.1作为定量离子对。选择MRM模式采集数据。在建立的LC-MS/MS检测条件下，牛肉空白样品在0~13.5 min内无干扰峰出现，基线平稳(图 1-B)；牛肉、肠、肾、肝及肺空白样品中加入红霉素和罗红霉素，在该色谱条件下保留时间分别为5.967 min和8.548 min，色谱峰之间无干扰，分离效果及峰形均良好(图 1-C~G)。
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图 1 红霉素(A)质谱图和牛肉空白样品(B)、空白牛肉样品中添加20 ng·mL-1红霉素及50 ng·mL-1罗红霉素(C)、空白牛肠样品中添加200 ng·mL-1红霉素及50 ng·mL-1罗红霉素(D)、空白牛肾样品中添加200 ng·mL-1红霉素及50 ng·mL-1罗红霉素(E)、空白牛肝样品中添加100 ng·mL-1红霉素及50 ng·mL-1罗红霉素(F)、空白牛肺样品中添加100 ng·mL-1红霉素及50 ng·mL-1罗红霉素(G)色谱图 Fig.1 HPLC-lus spectrum of erythromycin (A) and HPLC chromatograms of beef blank sample (B), erythromycin and roxithromycin added to blank beef samples(C), erythromycin and roxithromycin added to blank bovine samples(D), Adding erythromycin and roxithromycin to the blank bovine kidney sample(E), adding erythromycin and roxithromycin to the blank bovine liver sample(F), and adding erythromycin and roxithromycin to the blank bovine lung sample (G) |
取牛肉(肝、肾、肺、肠)样品各6份，分别加入质量浓度50 ng·mL-1内标溶液1 mL和加入红霉素对照品1 mL，按“2.1”项下的方法处理，使对照品溶液质量浓度为50 ng·mL-1，按照本法测定。结果如表 4。由表 4可知，该方法重复性良好，符合LC-MS/MS检测要求。
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表 4 牛可食性组织中红霉素重复性测定结果(n=6) Tab.4 Results of erythromycin repeatability determination in bovine edible tissues |
称取6份同1批次的牛肉(肝、肾、肺、肠)样品约5 g，按“2.1”项下方法处理得到20 mL乙腈下清液，准确称取1.05 mg红霉素于2 mL EP管中，加入乙腈下清液1.05 mL溶解，配制成1 mg·mL-1红霉素对照品储备液；准确称取0.47 mg罗红霉素于2 mL EP管中，加入乙腈下清液0.47 mL溶解，配制成1 mg·mL-1内标储备液，逐级稀释成高、中、低质量浓度(10、50、200 ng·mL-1)的红霉素标准溶液，取标溶液及内标各1 mL的混合标准溶液(每个浓度各3份)，进样5 μL，记录红霉素峰及内标峰的面积(A)，同时用纯乙腈溶液配制的相应质量浓度的红霉素及内标混合溶液进样5 μL，记录相应样本的红霉素及内标峰的面积(B)，通过A与B比值的百分比分别计算红霉素与内标的基质效应，计算比值的RSD，得到以内标基质效应校准后的红霉素基质效应RSD，要求RSD < 15%。低、中、高质量浓度的牛可食性组织样品中红霉素和内标基质效应均 < 15%。结果如表 5所示。
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表 5 牛可食性组织中红霉素基质效应测定结果(n=3，%) Tab.5 Determination of erythromycin matrix effect in bovine edible tissues |
应用SPSS 22.0软件对试验结果进行统计学分析，采用Graphpadprism5.0软件进行绘图和数据处理，试验数据用x±S表示。
3 讨论 3.1 定量方法的选择内标法定量准确，对操作条件和进样量要求低，抵消了上样体积、流动相及检测器的影响。试验结果显示，与没有使用内标物相比，使用内标物定量方法的准确度较高。目前，测定动物性组织中红霉素的残留多采用内标法，并且选择罗红霉素作为内标物[17,19]。罗红霉素是半合成的14元大环内酯类药物，红霉素需要经过合成才能变成罗红霉素，试验中添加罗红霉素是在测定之前片刻内加入的，不经过体内的过程，基本不影响检测精度；即使在罗红霉素代谢过程中，罗红霉素转化成红霉素的量也极少。有测定红霉素残留时选择同位素标记物(erythromycin，N，N-dimethyl-13C2)为内标物的报道[12]，但因其内标物成本偏高，对环境及试验条件的要求较苛刻，因而不利于普及。罗红霉素较常见，且与红霉素的理化、提取过程比较接近，基本不影响检测精密度。故最终选择罗红霉素作为其内标物。
3.2 提取剂的选择据文献报道，食品中红霉素的残留大多采用乙腈、氯仿、甲酸溶液等溶剂作为提取剂[18]。试验中根据药物极性和样本性质，提取剂分别选用了乙腈、氯仿和乙酸乙酯，对阴性红霉素牛肉样品进行红霉素添加试验，对回收率、环保及操作简便与否进行比较，选取3种溶剂中较为理想的提取剂。经对比试验得出：乙腈作为提取剂，对油脂和色素提取较少，易渗透入组织内部，提取效率高；而以乙酸乙酯作提取剂时，挥发性较大，易燃性强，价格较贵，透入动物组织中的能力较弱，若要提取完全需要长时间反复操作，导致试验所需时间延长，易造成红霉素在提取过程中的分解，加大了试验难度，此类溶剂在使用过程中具有一定的局限性；氯仿缺点在于毒性高且对环境污染较严重；因而，首选乙腈作为提取溶剂。
3.3 样品前处理的优化对比了正己烷的除脂次数，最后选用20 mL正己烷，分2次除脂效果最佳。也有报道[19]将组织样品采用固相萃取柱进行净化，但需求量较大。还对比了QuEChERS净化方法，效果差别不大，由于检测样品较多，此方法价格较贵。
3.4 样品检测因市场上难以找到红霉素残留的牛可食性组织样品，因此，尚未开展采用本方法对市售样品的检测工作，为此，在后续的研究中，需进一步完善本检测方法的重现性评价工作。
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