2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 新疆医科大学药学院, 乌鲁木齐 830011;
3. 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心, 乌鲁木齐 830000
2. College of Pharmacy, Xin Jiang Medical University, Urumqi 830011, China;
3. Center for Disease Control and Prevention, Urumqi 830000, China
林可霉素（lincomycin）属于林可胺类抗生素[1]，对革兰氏阳性菌有较强抗菌作用，对支原体也有抑菌作用，但对革兰氏阴性菌无效[2]。林可霉素临床上主要应用于肺炎球菌及厌氧菌所致的呼吸道感染、心内膜炎及厌氧菌所致的腹腔感染等，还可用于链球菌和葡萄球菌所致的败血症、慢性骨和关节感染的外科辅助治疗等[3]。林可霉素作为兽药，常被添加在饲料中或直接乳房注射治疗奶牛的乳房炎，但残留在乳腺管中的林可霉素，会经乳汁排出[4]，导致生鲜乳中抗生素残留，可引起消费者机体的过敏反应或抗药性[5]。中华人民共和国农业部公告第253号-2002规定，牛奶中林可霉素残留限量为100 ng·mL-1[6]。
在进出口动物源性食品SNT2218-2008林可胺类药物残留量检测方法中林可霉素的检测方法为液相色谱-串质谱法和质谱法，文献报道有酶联免疫吸附法（ELISA）[6-7]、化学发光法[7-8]、高效液相色谱法（HPLC）[9]、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）[10]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[11]及胶体金免疫层析法[12]等。嗜热链球菌抑制法和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法试验价格低廉，但样品前处理过程烦琐，重复性差[13]；HPLC及HPLC-MS法等方法灵敏度高，特异性好，但是仪器便携性差，价格昂贵，样品前处理复杂；ELISA方法灵敏度较高、快速、经济，适用于实验室大量样本初筛，不适合现场快速检测；胶体金免疫层析因快速、简便且经济实用，在食品检测的大量样本筛查中表现出较强的优势，但只能用于定性检测，而不能进行定量，筛选后的阳性样本需送实验室进行进一步定量分析。
本文基于背景荧光猝灭免疫层析技术，建立检测牛奶中林可霉素的方法，并将标准曲线的信息制成二维码，完善仪器系统，用于实际样品的测定，可在现场快速完成检测。
1 仪器与材料 1.1 仪器与材料背景荧光猝灭-免疫分析仪（ZC2015-0797，上海鑫谱生物科技有限公司）；林可霉素标准物质（Millipore公司，批号20160911，纯度98%）；林可霉素试纸条、固定有林可霉素金标抗体的小试杯（上海鑫谱生物科技有限公司，批号20160926），标准牛奶样品（经检测没有林可霉素，上海荣辉生物科技有限公司，批号20161011）；市售牛奶样品（新疆西域春乳业责任有限公司，批号20171204）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，pH7.4，天津灏洋华科生物科技有限公司）。
1.2 实验室自制牛奶供试品市售牛奶样品未检出林可霉素，为了验证背景荧光猝灭免疫层析法（background fluorescence quenching immunochromatographic assay，bFQICA）和国标规定方法的差异，本实验在市售牛奶样品中人为添加一定量的林可霉素标准物质，制成含一定浓度林可霉素的牛奶供试品，分别标记为004、005、006。
1.3 溶液的配制林可霉素储备液：将林可霉素标准物质用PBS配成1 μg·mL-1的林可霉素浓度标准溶液。
林可霉素系列浓度标准溶液：将1 μg·mL-1林可霉素标准溶液，用标准牛奶样品制成10、20、30、40、60 ng·mL-1的林可霉素系列浓度标准溶液。
2 方法与结果 2.1 测定原理与方法bFQICA的仪器系统部分包括检测卡体系和背景荧光猝灭免疫分析仪（Simple 1）（见图 1）[14]，仪器安装有Simple 1软件系统。背景荧光猝灭免疫层析分析仪的核心部件是检测卡，检测卡体系由5部分组成（见图 2）：底部固定有胶体金标记的目标物抗体（金标抗体）和胶体金标记的羊抗鼠抗体的小试杯，供试品溶液进行层析的样品垫，固定有荧光试剂的硝酸纤维素膜荧光区（可产生背景荧光F0），在荧光区包被有“目标物抗原-牛血清白蛋白偶联物”的测试线（T线），包被有“羊抗鼠抗原-牛血清白蛋白偶联物”的控制线（C线）。
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图 1 背景荧光猝灭-免疫层析分析仪及检测卡 Fig.1 Background fluorescence quenching immune chromatography and test card |
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图 2 背景荧光猝灭免疫层析检测示意图 Fig.2 Background fluorescence quenching immune chromatography assay |
检测原理：将一定量样品溶液，加入固定有金标抗体小试杯中，混匀（样品溶液中的待测目标物-林可霉素抗原与金标抗体特异性结合），吸取一定量的混合溶液滴加至样品垫上，通过毛细管作用进行层析。当混合溶液到达T线处，剩余的金标抗体与T线处的目标物-林可霉素抗原结合，形成抗原-金标抗体复合物，被截留在T线上，使背景荧光猝灭，以T线处荧光强度的测量值记为F1，荧光猝灭程度（F1/F0）与供试品中待测目标物含量有关。当供试品中目标物浓度大时，结合小试杯中金标抗体的量就多，小试杯中剩余的金标抗体与T线处“目标物抗原-牛血清白蛋白偶联物”结合的少，猝灭程度减弱，F1/F0的值增大。因此，零值样本F1/F0值最小，F1/F0随待测物浓度增大而增加。为对试纸条进行质控，在具有背景荧光的硝酸纤维素膜上还固定了“羊抗鼠抗原-牛血清白蛋白偶联物”（C线），当上述混合溶液继续前行到达C线处，金标羊抗鼠抗体与C线处的“羊抗鼠抗原-牛血清白蛋白偶联物”结合，使C线处的背景荧光发生一定的猝灭（见图 2）。说明试纸条质量合格。
2.1 反应时间与加样量的确定 2.1.1 反应时间的选择取200 μL标准牛奶样品，加到固定有金标抗体的小试杯中，混匀后吸取120 μL到加样孔中，分别层析8 min和10 min，用背景荧光猝灭-免疫分析仪检测，记录F1/F0的值，结果见表 1，层析时间为10 min时，RSD为4.3%，所以选择反应时间为10 min。
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表 1 不同反应时间的F1/F0 Tab.1 F1/F0 of different reaction time |
取200 μL标准牛奶样品，加到固定有金标抗体的小试杯中，混匀，再各吸取混匀后的标准牛奶样品80、100、120 μL分别到3个测试卡的加样孔中，层析10 min，用背景荧光猝灭-免疫分析仪检测，记录F1/F0的值，结果见表 2。当加样量为100 μL时，RSD为1.4%，故选择100 μL加样量。
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表 2 不同加样量的F1/F0 Tab.2 F1/F0 of different sample quantity |
取牛奶供试品200 μL至固定有金标抗体的小试杯中，充分混匀后吸取100 μL滴加到检测卡的加样孔，室温下层析10 min后，将检测卡插入仪器的插卡口，点击测定。
2.3 方法学验证 2.3.1 曲线方程与范围分别吸取“1.3”项林可霉素系列浓度标准溶液，按“2.2”项下方法操作，记录F1/F0，结果见表 3。以系列林可霉素质量用的为横坐标X，对应的F1/F0为纵坐标Y，进行回归，得回归方程：
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表 3 精密度结果 Tab.3 Results of precision |
Y=-5.000×10-6X3+0.000 4X2+0.001 6X+0.489 2
r=0.992 6
表明林可霉素质量浓度在0.0~60 ng·mL-1之间呈良好的相关性。标准溶液用PBS逐级稀释，以信噪比S/N=3计算检测下限为0.088 ng·mL-1。
2.3.2 精密度试验取“1.3”项下10、30、40 ng·mL-13个浓度的林可霉素标准溶液，按“2.2”项下方法操作，记录F1/F0，见表 3。低、中、高浓度林可霉素的F1/F0值的RSD（n=6）依次为1.3%、0.60%、1.1%。
2.3.3 加标回收率取市售牛奶样品1 mL置EP管中，分别加入1 μg·mL-1的林可霉素标准溶液20、30、40 μL，每个浓度平行3份，按“2.2”项下方法操作，记录各样品中林可霉素的检测浓度。结果显示，3种不同浓度（低、中、高）的牛奶样品中林可霉素平均加标回收率分别为103.4%、99.7%、98.5%，RSD分别为0.71%、0.82%、1.9%。
2.3.4 重复性试验取市售牛奶样品995 μL于EP管中，再加入1 μg·mL-1的林可霉素标准溶液5 μL，混匀，配成5 ng·mL-1牛奶供试品。按“2.2”项下方法操作，记录供试品中林可霉素检测值的F1/F0，计算测定浓度。结果显示，F1/F0平均值为0.5139，RSD为0.82%，浓度平均值为5.067 ng·mL-1，RSD为1.3%（n=6）。
2.3.5 稳定性试验取同一批次林可霉素检测卡和“2.3.1”项下林可霉素系列标准溶液，按“2.2”项下方法操作。每个月做1次标准曲线，连续做5个月。结果显示，5个月内，0、10、20、30、40、60 ng·mL-1系列标准溶液各点对应的RSD为0.42%、0.35%、0.39%、0.27%、0.24%、0.31%。
2.3.6 二维码的制作将获得的曲线方程和对应林可霉素名称输入二维码制码器，制成二维码，贴于检测卡上。
2.3.7 样品测定取“1.2”项下制备的004、005、006牛奶供试品分别采用背景荧光猝灭-免疫层析法和国标方法检测（表 7）。采用SPSS 17.0软件，对背景荧光猝灭-免疫层析法测定值和国标测定值经t检验分析，P > 0.05，说明bFQICA法和国标方法没有显著性差异。
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表 7 牛奶样品测定结果（x+s，n=3，μg·g-1） Tab.7 Determination of milk samples |
与传统测定林可霉素的方法相比，本方法是基于抗原、抗体的反应，所以专属性强。本研究中的硝酸纤维素膜上标记有背景荧光，胶体金猝灭剂与抗体结合，硝酸纤维素膜上的T线处固定有对应的抗原，当液体在试纸条上流动，T线处抗原-抗体-胶体金结合，引起T线处背景荧光猝灭，猝灭的程度用F1/F0表示，进行定量分析，所以检测灵敏度高。
本研究将检测牛奶中林可霉素标准曲线的信息制成二维码，不仅完善了检测卡，而且二维码的引用，可以使检测人员不用现场做标准曲线，使检测变得方便、快捷，本检测卡检测牛奶中林可霉素的时间为10 min；检测仪器内有内置WIFI，检测数据可立即发送；另外将制成的检测卡应用于牛奶样品的测定，结果与资质单位的检测结果用t检验分析，无明显差异。本方法灵敏度高，操作简便，反应时间短，可实现牛奶中林可霉素的现场快速定量检测，为本方法广泛地应用于食品安全领域奠定了基础。
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