2019, Vol. 39 
2. 广西卫生职业技术学院, 南宁 530029
2. Guangxi Medical Collage, Nanning 530023, China
磺胺嘧啶（sulfadiazine）为N-2-嘧啶基-4-氨基苯磺酸酰胺，属中效磺胺，是一种使用广泛的抗菌药[1]，其作为二氢叶酸合成酶的竞争抑制剂，达到阻碍叶酸合成的效果。磺胺嘧啶对革兰阳性及阴性菌均有抑制作用，可用于脑膜炎双球菌、肺炎球菌、淋球菌、溶加链球菌感染的治疗[2]。磺胺嘧啶原料药收载于《中华人民共和国药典》2015年版（ChP 2015）、英国药典（BP 2017）、美国药典（USP 40）、欧洲药典（EP 9.0），除ChP 2015外均有有关物质检查项，并且明确了5个有关物质（杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E）。前期参照BP 2017对磺胺嘧啶原料药进行有关物质检查试验中发现，国内的磺胺嘧啶原料药除检出杂质A、杂质C、杂质D外，还检测出其他未知的有关物质。为了有效地控制药物的质量，完善药物的有关物质检查，确保其安全性和有效性，特对12个有关物质进行UPLC-QTOF-MS结构鉴定。首先利用一级全扫描质谱得到各有关物质的精确分子质量和元素信息，再根据二级全扫描质谱获得碎片离子信息，并结合磺胺类药物生产工艺[3]及其常见的质谱裂解方式，推测其可能的化学结构。该方法快速有效，可为磺胺嘧啶原料药的生产工艺和质量控制提供参考依据。
1 仪器与试药Waters XEVO G2 Q-TOF液相质谱联用仪；Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；梅特勒XD205DU电子天平（0.1 mg）。
磺胺嘧啶原料（厂家A，批号170206、170511、170708）；对照品磺胺嘧啶（中国食品药品检定研究院，批号100026-201404，含量99.7%）、杂质A（2-氨基嘧啶）（Stanford Analytical Chemicals Inc，批号AL170221-13，含量98.9%）、杂质B（对氨基苯磺酸）（中国食品药品检定研究院，批号101180-201001，含量95.1%）、杂质C（磺胺脒）（中国食品药品检定研究院，批号100412-201302，含量92.0%）、杂质D（磺胺）（中国食品药品检定研究院，批号100024-201103，含量99.8%）；水为超纯水（电导率小于0.1 us·cm-1），乙腈为色谱纯（默克股份两合公司，批号JA046630），其他试剂均为分析纯。
2 实验方法 2.1 UPLC-QTOF/MS测定采用Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以乙腈-10 mmol·L-1醋酸铵溶液（30：70）为流动相，流速0.2 mL·min-1，进样量2 μL；质谱参数：采用ESI+离子源，正离子全扫描方式，扫描范围m/z 50~1 000，扫描时间0.3 s，喷雾电压2.5 kV，锥孔电压25 V，去溶剂温度500 ℃，去溶剂气体（N2）流速800 L·h-1。
2.2 溶液的制备 2.2.1 供试品溶液取磺胺嘧啶原料约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加氢氧化钠试液1 mL使溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度约为0.1 mg·mL-1供试品溶液。
2.2.2 杂质对照品溶液分别取磺胺嘧啶杂质A、杂质B、杂质C、杂质D适量，分别加氢氧化钠试液1 mL使溶解，用流动相稀释成质量浓度约为15 μg·mL-1的杂质对照品溶液。
2.2.3 降解试验取磺胺嘧啶原料分别进行强酸（1 mol·L-1盐酸溶液1 mL，60 min）、强碱（1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，30 min）、强氧化（10%过氧化氢溶液1 mL，30 min）、高温（105 ℃，1 d）和光照（4 500 lx，1 d）等破坏降解试验，再按“2.2.1”项下方法配制成降解溶液。
3 结果与讨论 3.1 有关物质检测分别取供试品溶液和降解溶液，按“2.1”项下方法进行测定，得到典型色谱图（见图 1），分别将各色谱各峰按保留时间的顺序编号为1~12。试验结果表明，在强酸条件下主要降解为有关物质1、3、5；在氧化条件下主要降解为有关物质1、2、6、7、11；在高温条件下主要降解为有关物质4；在光照条件下主要降解为有关物质3、4、5、8、9、10、11、12。各有关物质与主峰均得到有效分离，各杂质峰的分离度均能符合要求。
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1~12.同表 1（same as Tab. 1） A.供试品溶液（test solution）B.酸破坏（acid destruction）C.碱破坏（base destruction）D.氧化破坏（oxidation destruction）E.高温破坏（heat destruction）F.光照破坏（light destruction） 图 1 有关物质HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of related substances |
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表 1 磺胺嘧啶及其有关物质的高分辨质谱数据 Tab.1 Accurate mass measurements for impurities in sulfadiazine |
UPLC-QTOF-MS正离子模式下测得各有关物质母离子的准确质量与离子组成，三重四极杆质谱获得二级质谱碎片信息，通过与磺胺嘧啶及其有关物质对照品二级质谱碎片离子的比对分析，鉴定各有关物质结构。磺胺嘧啶与各有关物质的MS2子离子特征碎片列表分析见表 1。
磺胺嘧啶属于磺酰胺类药物，具有苯磺酰胺的基本母核。近年来有不少文献对磺酰胺类化合物的质谱碎裂机理进行了详细报道[4-7]，为此类化合物的结构解析提供理论依据。在串联质谱中，苯磺酰胺类质子化或去质子化离子都会发生丢失SO2中性碎片的碎裂反应，这被认为是苯磺酰胺类化合物的特征质谱丢失。另外，对氨基苯磺酰胺质子化离子容易发生S-N键断裂形成对氨基苯磺酰阳离子；同时，由于苯环对位氨基的共轭作用，促使氧原子发生亲核进攻引发C-S键的断裂，最终导致特征的SO中性碎片丢失。因此大多数磺胺类药物的共有5个特征碎片离子峰为[C6H6NSO2]+m/z 156、[C6H6NO]+m/z 108、[C6H6N]+m/z 92、[C5H6N]-m/z 80和[C5H5]+m/z 65。
在正离子模式下，磺胺嘧啶的[M+H]+准分子离子峰为m/z 251；碎片离子m/z 156是由母离子发生S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C6H6NSO2]+，即对氨基苯磺酰阳离子；碎片离子m/z 108是由离子[C6H6NO2S]+进一步发生C-S键断裂后丢失1个SO中性碎片后产生的[C6H6NO]+，该离子再进一步裂解而产生了[C5H5]+；碎片离子m/z 92是磺胺嘧啶母离子发生S-N键断裂后，正电荷保留在含N端产生的[C4H6N3]+；碎片离子m/z 185是由母离子发生S-N键和C-S键同时断裂后，失去HSO2，发生偶氮反应形成的[C10H9N4]+。推测裂解途径如下（图 2）。
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图 2 磺胺嘧啶可能裂解途径 Fig.2 Possible fragmentation pathway of sulfadiazine |
有关物质1的[M+H]+准分子离子峰为m/z 294，碎片离子中有与磺胺嘧啶一样的m/z 185、m/z 108、m/z 96、m/z 92、m/z 80、m/z 65，说明其基本母核与磺胺嘧啶一致。有关物质1的质量比磺胺嘧啶多43，推测其结构中引入了CH2NO。碎片离子中有m/z 96但是没有m/z 156，说明取代基不在嘧啶环上而是在苯环上；同时碎片离子m/z 199比m/z 156多出了43，也可以说明了取代基在苯环上。碎片离子m/z 199是由母离子发生S-N键断裂后，正电荷保留在含S端而形成的[C7H7N2SO3]+；碎片离子m/z 151是由离子[C7H7N2SO3]+进一步发生C-S键断裂后丢失1个SO中性碎片后产生的[C7H7N2O2]+，该离子又进一步发生C-N键断裂得到m/z 108。因此，推测其质谱裂解途径见图 3。
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图 3 有关物质1可能裂解途径 Fig.3 Possible fragmentation pathway of related substance 1 |
有关物质2的[M+H]+准分子离子峰为m/z 215，即为C7H11N4O2S+，推测其分子质量为214，经二级全扫描获得碎片离子仅有上述的5个共有特征离子：m/z 156、m/z 108、m/z 92、m/z 80、m/z 65，没有碎片离子m/z 96，说明该物质结构中没有2-氨基嘧啶。通过与杂质对照比较发现，有关物质2的碎片离子、保留时间和DAD紫外光谱图均与杂质C一致，因此可确证有关物质2为杂质C（磺胺脒）。推测其结构式及可能的质谱裂解途径见图 4。
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图 4 有关物质2可能裂解途径 Fig.4 Possible fragmentation pathway of related substance 2 |
有关物质3的[M+H]+准分子离子峰为m/z 173，即为C6H9N2O2S+，推测其分子质量为172。其分子式比磺胺嘧啶少C4H2N2，说明其结构可能少了1个嘧啶基，而二级质谱的碎片离子中没有m/z 96，也说明其结构中没有2-氨基嘧啶。碎片离子中发现有m/z 156，说明其结构含有对氨基苯磺酸的基本结构，因此推测其结构式及可能的质谱裂解途径见图 5。通过与杂质对照相比较发现，有关物质3的碎片离子、保留时间和DAD紫外光谱图均与杂质D一致，因此可确证有关物质3为杂质D（4-氨基-苯磺酰胺）。
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图 5 有关物质3可能裂解途径 Fig.5 Possible fragmentation pathway of related substance 3 |
有关物质4的[M+H]+准分子离子峰为m/z 413，m/z 435为有关物质4的[M+Na]+峰，推测其分子质量为412。碎片离子中有m/z 156和m/z 96，说明其结构中均含有对氨基苯磺酸和2-氨基嘧啶的结构。碎片离子m/z198和m/z134反应了取代基的信息，推测其苯氨基上连有乙酰基；碎片离子m/z318是由母离子丢失一分子的氨基嘧啶产生，该离子又同时发生S-N键和C-S键断裂后，失去SO2，发生偶氮反应形成m/z 254；碎片离子m/z318分子式比磺胺嘧啶多了C3H2NO，表明有关物质4不仅比磺胺嘧啶多了1个氨基嘧啶，还多了C3H2NO，其中还包含有乙酰基。推测其结构式及质谱裂解途径见图 6。
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图 6 有关物质4可能裂解途径 Fig.6 Possible fragmentation pathway of related substance 4 |
有关物质5的准分子离子峰为m/z 295，推测为[M+H]+峰，而m/z 312推测为[M+NH4]+峰，推测其分子质量为294。有关物质5的质量比磺胺嘧啶多44，推测其结构中可能引入了C2H4O。碎片离子中有m/z 96，说明含有2-氨基嘧啶结构，但是没有m/z 156碎片离子，说明结构中可能没有对氨基苯磺酸的基本结构，或者是对氨基苯磺酸的结构上可能有其他取代基；碎片离子m/z 172和m/z 124，证明对氨基苯磺酸的结构上有羟基取代。m/z 265是由母离子失去1分子乙基得到，再进一步发生S-N键和C-S键断裂后，失去SO2，发生偶氮反应形成m/z 201，因此推测其质谱裂解途径见图 7。
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图 7 有关物质5可能裂解途径 Fig.7 Possible fragmentation pathway of related substance 5 |
有关物质6的[M+H]+准分子离子峰为m/z 96，即为C4H6N3+，推测其相对分子质量为95。经二级全扫描获得碎片离子有m/z 79、m/z 69、m/z 53，推测其结构式及质谱裂解途径见图 8。通过与杂质对照比较发现，有关物质6的碎片离子、保留时间和DAD紫外光谱图均与杂质A一致，可确证有关物质6为杂质A（2-氨基嘧啶）。
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图 8 有关物质6可能裂解途径 Fig.8 Possible fragmentation pathway of peak related substance 6 |
有关物质7的[M+H]+准分子离子为m/z 267，即为C10H11N4O3S+，其质量比磺胺嘧啶多了16，说明该结构比磺胺嘧啶多了1个OH的取代基。碎片离子有m/z 156，说明母离子有对氨基苯磺酰的结构，没有m/z 96，说明母离子没有2-氨基嘧啶的结构或者是嘧啶基上有其他取代基，而碎片离子m/z 112可推测为2-氨基嘧啶基增加了1个OH。推测有关物质7的结构式及质谱裂解途径见图 9。
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图 9 有关物质7可能裂解途径 Fig.9 Possible fragmentation pathway of related substance 7 |
有关物质8的[M+H]+准分子离子峰为m/z 500，m/z 522为[M+Na]+峰，推测其分子质量为499，即为C19H18N9O4S2+。由碎片离子m/z 266和m/z 186推测可知，有关物质8的结构由2个嘧啶基和1个甲基构成，且通过碎片离子m/z 94可推测其含有苯胺基。碎片离子中没有磺胺嘧啶的特征碎片m/z 185，说明其结构中没有与磺胺嘧啶完全一致的结构。母离子失去1个2-氨基嘧啶得到碎片离子m/z 405，或是发生S-N断裂后再丢失1个SO中性碎片得到m/z 357；碎片离子m/z 341是由母离子丢失1个氨基密啶和1个SO2中性碎片得到；碎片离子m/z 186是由m/z 250失去1个SO2中性碎片得到。推测其结构式及质谱裂解途径见图 10。
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图 10 有关物质8可能裂解途径 Fig.10 Possible fragmentation pathway of related substance 8 |
有关物质9的[M+H]+准分子离子峰为m/z 285，m/z 307为[M+Na]+峰，推测其分子质量为284，其质量比磺胺嘧啶多了34，说明该结构可能比磺胺嘧啶多了1个Cl的取代基。碎片离子中没有发现m/z 156、m/z 108和m/z 80，说明4-氨基苯磺酸的苯环上可能有取代基。碎片离子m/z 189比m/z 156正好也多出34，因此可推断出Cl取代在苯环上。母离子发生S-N断裂，得到子离子m/z 189和m/z 95；m/z 189发生S-N断裂后丢失1个SO中性碎片得到m/z 142，或是丢失1个SO2中性碎片得到m/z 126。推测其结构式及质谱裂解途径见图 11。
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图 11 有关物质9可能裂解途径 Fig.11 Possible fragmentation pathway of related substance 9 |
有关物质10的[M+H]+准分子离子峰为m/z 251，其6个碎片离子均与磺胺嘧啶相同，推测有关物质10为磺胺嘧啶的同分异构体。
有关物质11的[M+H]+准分子离子峰为m/z 281，即为C10H9N4O4S+，其分子式比磺胺嘧啶多了2个O，说明在苯环的4位上可能是硝基取代基而不是氨基，而碎片离子中没有m/z 156、m/z 108、m/z 80，也正好说明了苯环上有其他取代基。母离子丢失1个SO2中性碎片得到m/z 217，丢失1个硝基得到m/z 234，推测其结构式及质谱裂解途径见图 12。
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图 12 有关物质11可能裂解途径 Fig.12 Possible fragmentation pathway of related substance 11 |
有关物质12的[M+H]+准分子离子峰为m/z 484，m/z 506为[M+Na]+峰，推测其分子质量为483。母离子失去1个氨基嘧啶（m/z 95）得到碎片离子m/z 389，再失去1个SO2中性碎片得到m/z 325。离子m/z 325为C16H13N4O4S+，可推测其结构比磺胺嘧啶多了一个苯环。碎片离子中没有离子m/z 156，说明其苯环上有其他取代基或者是氨基有取代基。碎片离子m/z 261是由离子m/z 325失去1个SO2中性碎片产生，再发生C-N键断裂，丢失1个氨基嘧啶得到m/z 168。碎片离子m/z 389丢失1个SO中型碎片得到m/z 341，再发生S-N键断裂，正电荷保留在含S端而产生m/z 246。推测其结构式及质谱裂解途径见图 13。
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图 13 有关物质12可能裂解途径 Fig.13 Possible fragmentation pathway of related substance 12 |
传统药物中的杂质结构鉴定，需要通过制备色谱分离纯化得到杂质单体，当杂质含量低时，制备就变得很困难[8]。近年来，通过液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法鉴定药物中杂质的研究也越来越多[9-15]，由于能获得分子离子和碎片离子的准确质量数，使得杂质的结构解析相对比较容易。通过分析碎片离子可知，m/z 156、m/z 108、m/z 92、m/z 80、m/z 65这5个碎片离子均为磺胺类药物裂解途径中最常见的碎片，有关物质2、3、4、7、8、10和磺胺嘧啶均检测出以上5个特征的碎片离子。
本试验采用UPLC-QTOF-MS技术对磺胺嘧啶原料中12个有关物质进行了结构解析，其中3个（有关物质2、3、6）为已知杂质，另外9个为未知杂质，均未曾有文献报道。
在上述实验条件下，对3个批次的磺胺嘧啶供试品进行杂质检测，均未检出BP2017中提出的杂质A、B、C、D、E，均检出有关物质8、9、10；以自身对照法计算杂质含量，结果见表 2。样品经氧化破坏后检出杂质A与C，经酸破坏与光破坏后检出杂质D。因此杂质A、C、D可归属于降解杂质。实验表明磺胺嘧啶在碱性条件下较为稳定，在光照条件下容易降解，提示样品应避光保存。
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表 2 磺胺嘧啶原料中杂质含量测定结果（%） Tab.2 The content results of the related substances in sulfadiazine |
本方法快速简便，获得了12个杂质的结构信息，为今后的磺胺嘧啶原料药有关物质检查和定向合成杂质对照品奠定基础，并为磺胺嘧啶的有关物质研究及杂质控制提供了有意义的实验数据和参考依据。
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