2019, Vol. 39 
盐酸奥洛他定滴眼液主要用于治疗过敏性结膜炎，作为眼部使用的无菌制剂，其无菌性是药品安全最为重要的指标之一，因其为多剂量包装产品，故而无菌性和抑菌效力在整个产品使用周期中显得异常重要。盐酸奥洛他定滴眼液所用的抑菌剂苯扎氯铵是目前应用最为广泛的眼用制剂抑菌剂之一，其安全性和有效性已得到了广泛认可，常用浓度为0.004%~0.02%[1]，其中普遍使用浓度为0.01%。苯扎氯铵为季铵盐类阳离子表面活性剂，具有广谱高效的杀菌能力，杀菌机制为破坏分子间的交互作用，使细胞膜脂质层瓦解，导致细胞质的泄露。其中革兰氏阳性菌对其最为敏感，而pH对苯扎氯铵的活性没有很大的影响。
苯扎氯铵虽被广泛使用，但仍有较多细胞毒性报道[2]，其对角膜和结膜上皮细胞均有一定的细胞毒性，同时可减弱角膜上皮细胞之间的连接，引起炎症反应，破坏泪膜，使干眼症症状加剧，并可渗入眼内导致神经毒性[3]。有研究表明[4]，苯扎氯铵毒性与浓度呈明显的相关性（0.02% > 0.015% > 0.01% > 0.005%），C12、C14/C12（58% C14和32% C12）或C12/C14（58% C12和32% C14）3种类型的苯扎氯铵，其15 min的细胞毒性呈明显的浓度依赖，而维生素E[5]和玻璃酸钠[6]对细胞有明显的保护作用。
对滴眼液中抑菌剂的研究发现，抑菌剂剂量过高是目前普遍存在的问题[7-9]，对抑菌剂的合理性评价刻不容缓。本文考察不同厂家盐酸奥洛他定滴眼液的抑菌效力和细胞毒性，并对含不同浓度抑菌剂的盐酸奥洛他定滴眼液的抑菌效力和细胞毒性进行研究，从而对抑菌剂添加的必要性和合理性进行综合评估，保证药品安全。
1 试验材料 1.1 菌种和细胞大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]均来自中国食品药品检定研究院，使用为3代；HConEpic[BNCC338598]人结膜上皮细胞来自上海细胞库。
1.2 试剂和培养基胰酪大豆胨液体培养基（批号171218）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号180427）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号180518）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号160316）均购自北京陆桥技术有限责任公司；RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清和1%双抗）来源于GIBCO公司。
试剂：pH 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液均来自GIBCO公司，细胞增殖检测CCK-8试剂盒来自日本同仁。
1.3 仪器SpectraMax paradigm全波长酶标仪；Esco CCL-170B-8 CO2培养箱；Esco AC2-4S1生物安全柜；BD240生化培养箱。
1.4 样品1批盐酸奥洛他定滴眼液样品（国产9批，A企业；原研2批，B企业）均来自2018年国家药品评价性抽验。
2 抑菌效力试验方法与结果 2.1 抑菌效力方法适用性试验结果按《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版四部[10]附录1105〈微生物计数法〉中常规法（1:10）、稀释法（1:50）和薄膜过滤法进行方法适用性试验。薄膜过滤法操作复杂，不利于进行多浓度多菌株的抑菌剂效力试验。采用常规法和稀释法同时进行方法适用性试验，发现回收率差异不大，而与菌株加入后混合时间影响较大。当样品与菌液混合后，立即加入培养基，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌和大肠埃希菌（由于苯扎氯铵对细菌的抑菌作用较强，对真菌的抑菌作用较弱，因此未对真菌进行考察）的回收率均能达到要求，但如果混合后放置时间变长（30 min时），金黄色葡萄球菌的回收率明显变低至63%，铜绿假单胞菌的降低至82%，这主要是抑菌剂苯扎氯铵的抑菌作用。因此，采用常规法进行方法适用性试验，菌液加入后立即放入平皿并加入培养基，结果（见表 1）均可达到70%的回收率。
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表 1 采用常规法进行验证的回收率结果（%） Tab.1 Results of validation recovery by routine pour-plate method |
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的新鲜琼脂培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10 mL洗下菌苔，混匀，取100 μL置10 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，即为108 cfu·mL-1菌悬液；取白色念珠菌的新鲜琼脂培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液2 mL洗下菌苔，混匀，即为108 cfu·mL-1白色念珠菌菌悬液；取黑曲霉的新鲜琼脂培养物，用5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管中，即为108 cfu·mL-1黑曲霉孢子悬液。
2.2.2 初始菌数测定取含0.9%无菌氯化钠溶液5 mL的试管5支，分别加入上述制备的5种108 cfu·mL-1菌悬液各50 μL，盖上内盖和外盖，充分混匀，10倍稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个浓度，每皿1 mL分别加入平皿中，每稀释级2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌分别加入胰酪大豆胨琼脂培养基，34 ℃培养48 h；白色念珠菌和黑曲霉加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，24 ℃培养72 h，计数。
2.2.3 抑菌效力试验方法取样品5支（每支5 mL），将内盖拔出，分别加入上述制备的5种108 cfu·mL-1菌悬液各50 μL，盖上内盖和外盖，充分混匀，置24 ℃培养箱中避光贮存28 d。分别于6、24 h和7、14、28 d取溶液1 mL（部分样品溶液28 d时不足1 mL，取0.5 mL至0.9%无菌氯化钠溶液4.5 mL中作为10-1稀释浓度），10倍稀释后按上述初始菌数方法进行培养并计数。
2.2.4 样品抑菌效力试验结果测定了11批次盐酸奥洛他定滴眼液，均符合《中国药典》2015年版[10]〈1121抑菌效力检查法〉中有关眼用制剂的要求，并且均能达到并远远高于其中“A”标准（表 2）。所有批次的滴眼液对细菌（大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌）均有较强的抑制，在6 h内均将所有的细菌完全杀死。差异主要在白色念珠菌和黑曲霉的抑制上，国产9批样品，在6 h白色念珠菌的抑制较弱，黑曲霉未完全抑制，而原研厂家的2批样品在6 h时，白色念珠菌和黑曲霉均完全抑制。原因可能与2个厂家所使用的苯扎氯铵不同有关，不同的分子结构，抑菌效力也有一定的差异。
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表 2 11批次样品抑菌效力结果 Tab.2 Results of antibacterial efficacy of 11 batches |
无抑菌剂盐酸奥洛他定滴眼液的配制：按企业提供的配方加入注射用水至400 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌即得；1%苯扎氯铵溶液的配制：取苯扎氯铵1.00 g加入注射用水100 mL，溶解，用0.22 μm滤膜过滤除菌，即得。
取无抑菌剂盐酸奥洛他定滴眼液与1%苯扎氯铵溶液，分别制成含苯扎氯铵0.01%、0.005%、0.003%、0.001%的盐酸奥洛他定滴眼液。分别取无抑菌剂及含不同浓度苯扎氯铵的滴眼液，按上述抑菌效力试验方法进行试验。
2.3.2 试验结果结果（表 3）可见，无抑菌剂组除了在14 d以后对金黄色葡萄球菌有一定的抑制外，对其他菌均无抑制；0.001%组细菌不符合规定，真菌仅能达到“B”级标准；0.003%组细菌不符合规定，真菌能达到要求；0.005%组全部符合规定，并能达到“A”标准；0.01%组全部符合规定，并能达到“A”标准。金黄色葡萄球菌对苯扎氯铵最为敏感，其次是大肠埃希菌和铜绿假单孢菌，而真菌的抑菌时间较长。
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表 3 含不同浓度苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液抑菌效力试验结果 Tab.3 Results of antibacterial efficacy of the olopatadine hydrochloride eye drops containing different concentrations of benzalkonium chloride |
将75 cm2细胞培养瓶（5代）中的细胞培养液吸掉，加入PBS，轻轻混匀，吸掉培养液后加入胰酶消化液2 mL，覆盖所有的细胞，置37 ℃培养箱中3 min，镜下观察细胞形态，加入6 mL培养液终止反应，用吸管吹下瓶壁上的细胞，移至离心管中，再用15 mL培养液分2次洗下剩余的细胞，合并后1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入10 mL培养液，混匀，测定细胞数，每孔200 μL（约5 000个细胞）加入48孔板中，置37 ℃CO2培养箱中培养24 h，用于细胞毒性考察。
3.1.2 含不同浓度苯扎氯铵溶液的配制取苯扎氯铵1.00 g，加入细胞培养液100 mL，溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌，制得1%苯扎氯铵溶液。取此溶液加入细胞培养液，制成不同浓度的苯扎氯铵溶液。
3.1.3 含不同浓度苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液配制按企业提供的配方加入细胞培养液至70 mL，0.22 μm滤膜过滤除菌，制得无抑菌剂盐酸奥洛他定滴眼液。取此溶液加入“3.1.2”项下配制的1%苯扎氯铵溶液，制成含不同浓度苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液。
3.1.4 药物刺激方法（1）含不同浓度苯扎氯铵溶液的培养液和含不同浓度的苯扎氯铵的滴眼液的药物刺激方法：吸出48孔板中原培养液，加入不同浓度（0.001%、0.003%、0.005%、0.01%）苯扎氯铵的培养液和含0.001%、0.003%、0.005%、0.01%不同浓度的苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液、阳性对照及阴性对照（无抑菌剂的培养液）各200 μL至细胞板中，每个浓度4个重复，37 ℃作用10 min。（2）盐酸奥洛他定滴眼液样品的药物刺激方法：吸出48孔板中原培养液，每孔加入细胞培养液150 μL与5批盐酸奥洛他定滴眼液样品1~5各50 μL，与阳性对照（0.02%的苯扎氯铵溶液）200 μL和阴性对照（无抑菌剂的细胞培养液）200 μL至细胞板中，每组4个重复，37 ℃作用15 min。
3.1.5 检测方法更换新鲜的培养液200 μL，去掉药物的影响，置倒置显微镜观察细胞形态并拍照，每孔中加入CCK-8溶液20 μL，在培养箱中孵育1 h，以不加入CCK-8溶液的细胞培养液为空白对照，用酶标仪测定450nm处的吸收度。
3.1.6 计算方法| $ 细胞相对存活率 = \frac{{{A_{加药}} - {A_{空白}}}}{{{A_{阴性}} - {A_{空白}}}} \times 100\% $ |
结果见表 4。从0.001%至0.01%，随着防腐剂浓度的增强，细胞的毒性增强，存活率降低，IC50=0.007 0，R2=0.875，当苯扎氯铵0.01%时，细胞相对存活率为26.7%。
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表 4 不同浓度的苯扎氯铵细胞相对存活率结果 Tab.4 Cell relative survival rate results of different concentrations of benzalkonium chloride |
由表 5可见，当无抑菌剂的盐酸奥洛他定滴眼液作用于细胞时，细胞相对存活率达96.9%，可见奥洛他定原料对人结膜上皮细胞毒性很低。添加0.001%~0.005%抑菌剂后，细胞相对存活率变化也不明显；抑菌剂浓度增加到0.01%时，细胞毒性明显增强，存活率仅25.7%，与单独用0.01%苯扎氯铵作用细胞的存活率26.7%很相近。IC50=0.008 0，R2=0.935，显微镜检图谱见图 1和图 2，从镜检可见，用0.01%苯扎氯铵作用后的细胞已经变形紧缩，细胞间的连接变少，部分细胞已经破裂死亡。
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表 5 含不同浓度苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液细胞相对存活率结果 Tab.5 Cell relative survival rate results of the olopatadine hydrochloride eye drops containing different concentrations of benzalkonium chloride |
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图 1 人结膜上皮细胞HConEpic镜检图（10×40） Fig.1 Microscope of HConEpic human conjunctival epithelial cell(10×40) |
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图 2 含0.01%的苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液作用人结膜上皮细胞的HConEpic镜检图（10×40） Fig.2 Microscope of effecting HConEpic human conjunctival epithelial cell with the olopatadine hydrochloride eye drops containing 0.01% benzalkonium chloride(10×40) |
对不同厂家不同批号的盐酸奥洛他定滴眼液进行细胞毒性考察，结果见表 6。由结果可见，国产企业3批滴眼液细胞存活率略高，88%左右；原研厂家2批滴眼液细胞存活率略低，78%左右。对数据进行方差分析，F=12.74（Fcrital=10.13），P=0.037（α=0.05），可见国产企业和原研厂家的细胞存活率存在显著性差异。究其原因，可能是受不同结构苯扎氯铵的影响，由于未得到原研厂家的原辅料，所以没有得出确切的原因。
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表 6 不同厂家的盐酸奥洛他定滴眼液细胞相对存活率结果 Tab.6 Cell relative survival rate results of the olopatadine hydrochloride eye drops of different enterprise and batch |
本品的处方中除抑菌剂外，仅含有奥洛他定和无机盐类，奥洛他定作为抗过敏类药物，本身并无很强的抑菌性，通过无抑菌剂的对照组也可以看出，除了在14 d到28 d，本品会对金黄色葡萄球菌有部分的抑制外，对其他细菌和真菌均无明显的抑制，说明该产品添加抑菌剂很有必要。
4.2 抑菌剂添加的合理性[11-12]本品处方中含抑菌剂苯扎氯铵0.01%，为滴眼剂中使用最多的抑菌剂及浓度。通过不同浓度抑菌剂的抑菌效力试验可见，0.005%浓度的苯扎氯铵即可满足2015年版《中国药典》中抑菌效力的要求，可见抑菌剂添加普遍存在过量的现象。进一步的细胞毒性试验可见，0.01%苯扎氯铵对于人结膜上皮细胞具有一定的毒性，因此，为了保证产品的安全性，抑菌剂浓度应当降低。此外，很多具有一定杀菌作用的滴眼液也添加同等剂量的抑菌剂，抑菌剂添加必定过量。可见抑菌剂添加超量比较普遍，降低抑菌剂的使用量很有必要。
4.3 抑菌剂的细胞毒性评价盐酸奥洛他定滴眼液主要应用于过敏性结膜炎的治疗，有文献报告[13]苯扎氯铵对人结膜上皮的细胞毒性强于人角膜上皮细胞，此外奥洛他定主要用于治疗过敏性结膜炎，此时人结膜上皮细胞处于受伤的状态，因此选用人结膜上皮细胞作为研究对象。考察了不同浓度的苯扎氯铵的细胞毒性与含不同浓度苯扎氯铵的盐酸奥洛他定滴眼液细胞毒性，从结果来看，盐酸奥洛他定无明显的细胞毒性，而添加了不同浓度的苯扎氯铵后，细胞毒性与浓度呈明显的正相关，0.01% > 0.005% > 0.003% > 0.001%。从0.001%至0.005%，细胞毒性增加不是很明显，而从0.005%至0.01%，细胞毒性增加较快，盐酸奥洛他定中的苯扎氯铵的使用浓度为0.01%时，作用10 min细胞相对存活率仅为25.7%。本文研究结果与以文献报道[3]的结果基本一致。尽管无法重复出人体使用时真正的细胞毒性，但在满足抑菌效力的前提下，应尽可能地降低细胞毒性。通过抑菌效力考察，含0.005%苯扎氯铵的盐酸奥洛他定已经能够满足药典要求，而0.005%苯扎氯铵的细胞毒性比0.01%的显著降低，因此，降低抑菌剂浓度非常必要。
4.4 滴眼剂包装量的改进目前单剂量包装的滴眼液越来越多[14-15]，但此品种并无单剂量包装，且生产企业由于考虑包材、工艺、生产成本及部分农村地区人们使用偏好性，因此并无相关的研究和考虑。由于本品为抗过敏用药，使用人员并非能够完全使用到28 d，故而改成小剂量包装而非单剂量包装，降低抑菌剂的浓度，既符合人们的用药习惯，又可以降低抑菌剂的浓度，降低细胞毒性，也是个很好的研究方向。
4.5 抑菌剂种类的改进文献报道[5]，对于长期使用的眼用制剂或隐形眼镜护理液等生产厂家普遍更换细胞毒性较低的抑菌剂，如Alcon开发的新型抑菌剂聚季铵盐-1，其抑菌效力与苯扎氯铵相近，而细胞毒性比苯扎氯铵小很多。因此，尽管很多眼用制剂不长期使用，但从降低眼部细胞毒性的角度，也应考虑更换一些毒性小的抑菌剂。
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