2019, Vol. 39 
2. 北京悦康科创医药科技股份有限公司, 北京 100076
2. Beijing Youcare Kechuang Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Beijing 10076, China
阿加曲班是1种新型凝血醇抑制剂，可逆地与凝血酶活性位点结合，可用于缺血性脑梗死急性期病人的抗凝治疗，用于肝素诱发的血小板减少和血栓综合症，比肝素有更好的抗凝和抗血栓作用[1-5]。阿加曲班的合成中会使用到3-甲基-8-喹啉磺酰氯（杂质D），若未在工艺中完全除去，易与后续合成反应中使用的有机溶剂如甲醇、乙醇反应，生成3-甲基-8-喹啉磺酸甲酯（杂质B）、3-甲基-8-喹啉磺酸乙酯（杂质C），杂质D在工艺中遇水也会水解成3-甲基-8-喹啉磺酸（杂质A）[6-7]（图 1）。杂质A、B、C和D均具有潜在的基因毒性。
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图 1 杂质的结构式 Fig.1 Structural formulas of genotoxic impurities |
根据欧洲药事管理局和美国食品药品管理局的法规要求[8-9]，基因毒性杂质的毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）限度为1.5 μg·d-1，阿加曲班每日最高服用剂量为60 mg，因此，阿加曲班中杂质A、B、C和D的限度均为25 μg·g-1，总限度值也是25 μg·g-1。现有文献尚未见阿加曲班基因毒性杂质测定的报道，因此，有必要建立阿加曲班中杂质的检测方法。
目前，喹啉磺酸类杂质主要的检测方法是液相色谱法（LC）[10-11]。LC法灵敏度较低，多组分分析有时无法有效分离；液相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、分析速度快、结果准确可靠的特点，可以满足痕量毒性杂质检测的要求[12-16]。本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）测定阿加曲班中4种基因毒性杂质，并进行了相应的方法学验证，为阿加曲班的工艺和质量控制提供参考依据。
1 仪器与试药Acquity超高效液相色谱仪（Waters公司），XEVO TQ串联质谱仪（Waters公司），质谱软件为Masslynx4.1工作站；XPE105电子天平（0.01 mg，梅特勒托利多公司）；Milli-Q超纯水器（Millipore公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）。
阿加曲班原料药、杂质A~D的对照品（含量100%）均由北京悦康科创医药科技股份有限公司提供；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱级（默克公司）。
2 方法与结果 2.1 色谱质谱条件 2.1.1 色谱条件液相色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈溶液为流动相B；梯度洗脱（0~6 min，10%B→90%B；6~8min，90%B；8~8.5 min，90%B→10%B；8.5~10 min，10%B）；流速0.2 mL·min-1；柱温35 ℃；进样体积5 μL。
2.1.2 质谱条件采用电喷雾正离子化（ESI+）测定3个基因毒性杂质，优化后的参数如下：毛细管电压3.0 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流速650 L·h-1，锥孔气流速20 L·h-1，萃取电压5.0 V。多反应监测（MRM）模式检测，外标法定量。共分2段进行监测：0~3.5 min多反应监测杂质A（m/z 223.8→m/z 142.0），0~10 min多反应监测杂质B（m/z 237.9→m/z 142）、杂质C（m/z 251.9→m/z 224.0）、杂质D（m/z 241.8→m/z 115.0），其他实验参数见表 1。
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表 1 基因毒性杂质的质谱条件 Tab.1 MS/MS acquisition parameters for genotoxic impurities |
水与乙腈等比例（50:50）混合。
2.2.2 杂质对照溶液由于杂质D在含水相体系中水解成杂质A，因此本实验杂质D的含量由杂质A代替，杂质D的方法学数值不再关注，如样品中检测到杂质D，则说明其含量超过限度值。取杂质A~C各约10 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，杂质A加水溶解，杂质B和杂质C用乙腈溶解，均稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中各约含1.0 mg的杂质对照品储备液。精密移取各杂质对照品储备液0.1 mL，置同一10 mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，40 ℃放置8 h，制成每1 mL中含各杂质均约为10 μg的杂质混合溶液。精密移取杂质混合溶液0.25 mL，于10 mL量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL中含杂质A~C均约250 ng的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液取阿加曲班原料药约100 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加稀释剂约10 mL溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL中含阿加曲班约为100 mg的溶液，将该溶液于40 ℃放置8 h，即得。
2.3 专属性试验在所建立的色谱和质谱条件下，杂质A~C的保留时间分别为1.32、3.85、4.31 min，3个基因毒性杂质完全分离，峰形良好。空白稀释剂、供试品溶液和杂质对照溶液中各杂质的检查无干扰（图 2）。
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图 2 杂质对照品溶液总离子流图 Fig.2 Total ion chromatograms of genotoxic impurities reference substance solution |
取杂质A~C对照品储备液，逐级稀释，直至各杂质峰峰高约为基线噪音的10倍，测得杂质A、B、C的定量下限分别为5.0、0.125、0.25 ng·mL-1；连续进样6次，杂质A、B、C峰面积的RSD分别为2.6%、2.4%和1.9%，表明定量下限具有良好的精密度。
取上述定量下限用溶液，用稀释剂稀释后进样测定，直至各杂质峰高约为基线噪音的3倍，测得杂质A、B、C的检测下限分别为1.667、0.042、0.083 ng·mL-1。
2.5 线性关系考察精密量取“2.2.2”项下杂质混合溶液适量，用稀释剂定量稀释成各杂质的质量浓度均分别约为25、50、250和500 ng·mL-1（各相当于限度浓度的10%、20%、100%和200%）的系列溶液，与定量下限溶液一起，照“2.1”项下条件分别进样测定，记录色谱图。以质量浓度（X，ng·mL-1）为横坐标，主峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。杂质A、B、C线性回归方程分别为：
Y=456.6X+887.59 r=0.998 4
Y=7 807X+85.52 r=0.999 8
Y=4 527X+182.69 r=0.999 7
结果表明，各杂质在其线性范围内与其峰响应值呈良好线性关系。
2.6 进样精密度和重复性试验取“2.2.2”项下杂质对照溶液，连续进样6次，计算得杂质A、B、C峰面积的RSD分别为2.1%、1.5%和2.0%，表明进样精密度良好。
取阿加曲班原料药样品适量，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，均未检出杂质；精密移取杂质混合溶液0.25 mL，置10 mL量瓶中，按“2.2.3”项下方法，配制含杂质A、B和C质量浓度均约为250 ng·mL-1的供试品溶液6份，进样测定，计算得杂质A、B和C峰面积平均值分别为113 740、1 902 150、1 188 134，RSD分别为2.4%、1.3%、0.84%，表明方法重复性良好。
2.7 溶液稳定性试验取“2.2.2”项下杂质对照溶液，室温放置24 h，分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定，结果杂质A、B、C峰面积的RSD分别为2.6%、2.2%、3.0%，表明24 h内杂质A、B、C在溶剂中的稳定性良好。
2.8 回收率试验精密取阿加曲班原料药样品各9份，每份约100 mg，分别置10 mL量瓶中，精密加入“2.2.2”项下杂质混合溶液0.20、0.25、0.30 mL，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得低（200 ng·mL-1）、中（250ng·mL-1）、高（300 ng·mL-1）3个浓度的供试溶液各3份，进样分析，根据“2.5”项下线性方程计算，杂质A低、中、高浓度下的平均回收率（n=3）分别为91.5%、93.8%、94.9%，RSD分别为2.1%、4.6%、3.1%；杂质B低、中、高浓度下的平均回收率分别为93.9%、94.6%、93.3%，RSD分别为0.74%、0.15%、0.22%；杂质C低、中、高浓度下的平均回收率分别为101.5%、104.2%、103.2%，RSD分别为0.41%、0.95%、0.54%，方法回收率良好。
2.9 样品检测取3批阿加曲班原料药样品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液；按“2.2.2”项下方法制备杂质对照溶液；精密量取供试品溶液与杂质对照溶液各5 μL，分别注入超高效液相色谱质谱仪，按外标法以峰面积计算阿加曲班中杂质A、B、C和D的含量。结果显示，3批样品中均未检出杂质A、B、C和D。
3 讨论 3.1 水解时间和水解温度的优化本实验研究了杂质D生成杂质A的水解时间和水解温度。直接配制500 ng·mL-1杂质D的溶液，在室温和40 ℃条件下分别放置0、2、4、6、8、10 h，然后取出配制成杂质D的杂质对照溶液，分别进样，观察杂质A与杂质D的峰面积变化情况。结果表明（图 3、4）：0 h时，杂质D即可水解生成杂质A；随着时间延长，杂质D的峰面积逐渐变小；8 h时，40 ℃下杂质D已全部水解为杂质A；而直到第10 h，室温条件下还有杂质D尚未完全水解。因此，本实验选择在40 ℃水解8 h。
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图 3 0 h基因毒性杂质A和D总离子流图 Fig.3 Total ion chromatograms of genotoxic impurity A and D at 0 h |
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a.室温（room temperature）b.40 ℃ 图 4 不同温度下杂质D峰面积随时间变化图 Fig.4 Variation of genotoxic impurity D peak area with time atdifferent temperatures |
分别取杂质A、B、C和D的对照品，按“2.2.2”项下方法配制质量浓度为10 μg·mL-1的单标标准溶液，采用蠕动泵方式将其单独注入质谱的离子源中，在正离子（ESI+）、负离子（ESI-）模式下进行全扫描，选择合适的准分子离子峰和电离方式。结果表明，在ESI+模式下，4个杂质均可获得较高丰度的[M+H]+准分子离子峰。对离子源温度、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量进行优化，使待测物质的离子化效率达到最佳。
3.3 色谱条件的优化考察了乙腈-水、甲醇-0.1%（v/v）甲酸水溶液、乙腈-0.1%（v/v）甲酸水溶液作为流动相体系对目标化合物分离效果的影响。结果显示，以乙腈为有机相时，各待测物响应强度稳定，且色谱峰形较好；以甲醇为有机相时，杂质A响应值明显降低；在流动相中加入甲酸，提高了目标化合物的离子化效率，获得了更高的灵敏度。故实验选择乙腈-0.1%（v/v）甲酸水溶液体系作为流动相。
3.4 结论经方法学试验验证，本方法能够对阿加曲班中的4个痕量基因杂质进行准确测定，方法专属性强，灵敏度高，能满足杂质定量检测的要求，可作为阿加曲班基因毒性杂质的质量控制方法。
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