2019, Vol. 39 
盐酸二甲双胍和格列本脲均为临床常用的降糖药，两者作用机制不同，联用具有协同作用，减少用药量，降低不良反应，可有效地发挥控制血糖的作用[1-2]。目前国内对二甲双胍格列本脲片的研究多是对盐酸二甲双胍和格列本脲含量的研究，对有关物质尤其是格列本脲特定杂质的分析较少[3-8]。本文主要对格列本脲的有关物质进行了研究。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版和美国药典40版[9-10]收载的二甲双胍格列本脲片质量标准均采用HPLC法测定格列本脲有关物质，《中国药典》2015年版控制了已知杂质格列本脲杂质Ⅰ和Ⅱ，美国药典40版控制了已知杂质Ⅰ，其他杂质作为未知杂质进行控制。欧洲药典9.0版格列本脲项下共收载5个已知杂质[11]，其中，杂质A与《中国药典》2015年版杂质Ⅰ相同。各已知杂质结构见图 1。参考上述二甲双胍格列本脲片药典方法，重点关注复方制剂中相关的辅料对杂质检测的干扰以及强制降解试验中主药与各杂质的分离情况，建立了测定格列本脲有关物质的HPLC法。
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图 1 格列本脲各已知杂质的结构式 Fig.1 Structures of glyburide's known impurities |
Agilent 1260型高效液相色谱法色谱仪（安捷伦公司），U3000型高效液相色谱仪（ThermoFisher公司），Inertsil C8-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：辛烷基硅烷键合硅胶；岛津公司）；EX125DZH型十万分之一分析天平（奥豪斯公司）；KQ-500E超声波清洗器（500 W，40 kHz；昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试药二甲双胍格列本脲片（Ⅱ）（自制，批号为20180208、20180208-2，规格：5 mg格列本脲与500 mg盐酸二甲双胍）；二甲双胍格列本脲片（Ⅱ）（三门峡赛诺维制药有限公司，批号为180202，规格：5 mg格列本脲与500 mg盐酸二甲双胍）；对照品格列本脲（含量99.5%，批号100135-201105）、杂质Ⅰ（含量100.0%，批号100149-200603）、杂质Ⅱ（含量100.0%，批号100150-201504），中国食品药品检定研究院；盐酸二甲双胍对照品（由原料标定而得，含量99.5%，批号P031-170219-R）；杂质B对照品（USP，含量100.0%，批号FOF178）；杂质C对照品（TLC，含量99.3%，批号2192-002A5）；杂质D对照品（LGC，含量99.4%，批号147108）；杂质E对照品（TLC，含量98.5%，批号2208-083A2）。
乙腈（色谱纯，Merck公司），磷酸二氢铵（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），磷酸（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂），水为自制纯化水。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 供试品溶液取二甲双胍格列本脲片（Ⅱ）30片，研细，取细粉适量（约相当于格列本脲12.5 mg），精密称定，置50 mL量瓶中，加稀释剂[乙腈-水（50:50）]适量，超声（500 W，40 kHz）20 min使格列本脲溶解，放冷，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.2 对照溶液精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 对照品储备液取杂质Ⅰ（杂质A）、Ⅱ、B、C、D、E和格列本脲的对照品适量，精密称定，用稀释剂溶解配制成各杂质和格列本脲对照品储备液，根据各检测项下要求，分别稀释配制溶液。
2.1.4 混合对照品溶液取各杂质对照品储备液适量，用稀释剂定量稀释制成每1 mL中含杂质Ⅰ约1.5 μg、杂质ⅡB、C、D、E各约0.5 μg的混合溶液，即得。
2.1.5 系统适用性溶液取格列本脲对照品、杂质Ⅰ对照品和盐酸二甲双胍对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1 mL中含格列本脲0.25 mg、杂质Ⅰ1.5 μg和盐酸二甲双胍25.0 mg的溶液，作为系统适用性溶液。
2.2 色谱条件与系统适用性色谱柱为Inertsil C8-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为pH 3.5的磷酸二氢铵溶液（取磷酸二氢铵1.725 g，加水300 mL溶解，用磷酸调节pH至3.5±0.05），流动相B为乙腈，进行梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，柱温为40 ℃，检测波长为230 nm，进样量为20 μL。梯度洗脱程序见表 1。
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表 1 梯度洗脱程序 Tab.1 The program of gradient elution |
精密量取系统适用性溶液20 μL注入液相色谱仪，进样测定，记录色谱图。在上述色谱条件下，格列本脲重复进样的RSD（n=5）为0.04%；格列本脲杂质Ⅰ重复进样的RSD（n=5）为1.7%，系统适用性良好。
2.3 专属性试验取本品，约相当于格列本脲2.5 mg，分别置10 mL量瓶中，在不同条件下进行强制降解试验，条件如下：（1）未破坏样品；（2）酸破坏：加1 mol·L-1盐酸2 mL，置60 ℃水浴中，破坏2 h；（3）碱破坏：加1 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL，置60 ℃水浴中，破坏6 h；（4）光照破坏：药物光照稳定性试验箱中放置5 d；（5）高温破坏：60 ℃水浴中，破坏6 h；（6）氧化破坏：3%双氧水1 mL，室温放置17 h。6种条件下的样品均用乙腈定容至刻度，同时取空白辅料适量，置10 mL量瓶中，采用与样品相同的破坏方式，制备各破坏条件下的空白辅料样品，精密量取各溶液20 μL注入液相色谱仪测定，色谱图见图 2。空白溶剂、空白辅料样品无干扰；经强酸、高温和氧化强制降解后，降解杂质主要为杂质Ⅰ；在光照和强碱条件下相对稳定。降解试验后各杂质与主成分的分离度均符合规定，同时，对样品进行物料平衡的计算（以未经破坏样品的主峰为100%），结果表明，各破坏后样品的主峰与杂质峰面积总和，均在95%~105%范围内，物料基本守恒。
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1.杂质Ⅰ（impurity Ⅰ）2.杂质B（impurity B）3.格列本脲（glyburide）A.酸降解（acid degradation）B.碱降解（base degradation）C.光照降解（light degradation）D.高温降解（high temperature degradation）E.氧化降解（oxidation degradation） 图 2 降解试验色谱图 Fig.2 Chromatograms of degradation tests |
取各成分对照品储备液，逐步稀释后依法进样，记录峰面积，选取信噪比约为10:1时对应的各杂质的浓度作为样品的定量下限，3:1时对应的各杂质的浓度作为样品的检测下限，结果格列本脲杂质Ⅰ、Ⅱ、B、C、D、E和格列本脲定量下限分别为0.037、0.016、0.021、0.074、0.049、0.073和0.049 μg·mL-1，检测下限分别为0.011、0.004 7、0.006 2、0.022、0.015、0.022和0.015 μg·mL-1。
2.5 线性关系考察分别精密量取各成分对照品储备液适量，配制成浓度分别为定量下限、杂质限度（杂质Ⅰ限度为0.6%，其他0.2%）20%、50%、80%、100%、150%的线性溶液。将线性溶液注入液相色谱仪，记录峰面积，以杂质浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，在定量下限至限度150%内以峰面积对溶液浓度进行线性回归，得线性方程，根据回归方程计算相对校正因子[12]，结果如表 2所示。
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表 2 杂质回归方程 Tab.2 Regression equations of impurity |
取各杂质对照品储备液，按照“2.1.4”项下方法配制对照品溶液；按照“2.1.1”项下方法平行配制2份供试品溶液，作为未加标溶液；另称取6份样品，向样品中加入100%限度浓度的杂质对照品，作为加标溶液。取上述各溶液，分别进样测定，以外标法计算各杂质的回收率，6份加标溶液杂质Ⅰ、Ⅱ、B、C、D、E平均回收率分别为104.5%、102.6%、101.2%、101.3%、102.3%和105.1%，RSD分别为1.8%、0.23%、0.34%、1.5%、0.27%和0.43%，表明方法的重复性良好。
2.6.2 中间精密度溶液配制方法同重复性试验，在不同的日期，由不同的实验人员操作检测，测得6份加标溶液杂质Ⅰ、Ⅱ、B、C、D、E平均回收率分别为103.2%、101.1%、100.5%、101.0%、101.2%和104.3%，RSD分别为1.0%、0.49%、0.22%、1.9%、0.39%和0.58%。12份加标溶液杂质Ⅰ、Ⅱ、B、C、D、E回收率的RSD分别为1.6%、0.89%、0.48%、1.6%、0.65%和0.65%，表明方法的中间精密度良好。
2.7 溶液稳定性取“2.6.1”项下加标溶液，于室温条件下放置24 h，分别在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，格列本脲、杂质Ⅰ、Ⅱ、B、C、D、E峰面积的RSD分别为0.12%、4.9%、0.37%、0.19%、0.94%、0.31%和0.19%，说明各成分在0~24 h内无明显变化，因此溶液可于室温稳定保存24 h。
2.8 加样回收率试验取本品细粉9份，平均分为3组，每组3份，每份约相当于格列本脲12.5 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，分别加入杂质对照品适量，使杂质浓度分别为限度浓度的50%、100%和150%，加稀释剂适量，超声20 min，放冷，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为回收率供试溶液；精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果见表 3，各杂质在3个不同浓度水平的回收率均在90%~110%之间，符合规定。
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表 3 回收率试验结果（n=9） Tab.3 Results of recovery |
改变柱温（38、42 ℃）、检测波长（228、232 nm）、流动相pH（pH 3.3、pH 3.7），照有关物质测定方法进行测定。结果表明，柱温、检测波长、流动相pH的变化未导致分离效果、检出的杂质个数发生明显变化，该方法耐用性良好。
2.10 样品有关物质的检测取3批样品，制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图。6个已知杂质按外标法计算，其他杂质按自身对照法计算，3批样品的有关物质测定结果见表 4。其中检出的已知杂质分别采用加校正因子的自身对照法再次计算含量，结果见表 5。
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表 4 有关物质测定结果（%） Tab.4 The results of determination of related compounds |
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表 5 杂质Ⅰ和杂质B测定结果（%） Tab.5 The result of determination of related impurityⅠand B |
杂质Ⅰ和杂质B采用外标法和加校正因子的自身对照法分别计算，结果基本一致，表明校正因子计算法较为准确，可以用于杂质的计算，能够真实反映格列本脲的有关物质含量，并简化杂质对照品的使用。
3 讨论 3.1 检测波长的选择《中国药典》2015年版二甲双胍格列本脲片Ⅱ质量标准格列本脲有关物质测定波长为300 nm，美国药典40版测定波长为230 nm，本研究对格列本脲以及格列本脲各杂质对照品溶液在190~400 nm进行全波长紫外扫描，格列本脲在230、300 nm附近有吸收峰，而各杂质均在230 nm附近有最大吸收，所以选择230 nm作为检测波长。
3.2 盐酸二甲双胍对测定的影响本品为复方制剂，另1个主药成分为盐酸二甲双胍，且两者含量相差较大，为避免二甲双胍峰对杂质测定的影响，梯度中乙腈起始比例设置较低，可以使格列本脲以及杂质的出峰时间延长，而盐酸二甲双胍极性较大，在试验条件下，出峰较快，不影响杂质和格列本脲的测定。
3.3 杂质限度的确定本品标准中杂质限度的制定，要求不低于《中国药典》2015年版和美国药典40版中二甲双胍格列本脲片质量标准，具体为杂质Ⅰ不得过0.6%，杂质Ⅱ、B、C、D、E和其他单个杂质均不得过0.2%。
3.4 杂质分析及控制测定了格列本脲已知杂质的校正因子，并采用加校正因子的自身对照法计算各杂质的含量，结果与外标法计算结果基本一致，表明校正因子测定较为准确。杂质Ⅱ、B、D的相对校正因子均在0.9~1.1之间，可以采用自身对照法[13]进行控制；而杂质Ⅰ、C和E的相对校正因子分别为0.80、1.76和1.18，可以采用加校正因子的自身对照法计算各杂质的含量。
综上所述，本试验采用HPLC法测定二甲双胍格列本脲片Ⅱ中格列本脲的有关物质，方法学研究显示，该方法专属、准确，且通用性比较好，可以用于格列本脲有关物质的测定，为该药的进一步研究开发提供了有效的质量控制方法。
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