沙坦类药物即血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB)类抗高血压药物，可通过与血管紧张素Ⅱ受体中的AT1受体特异性结合，阻断血管紧张素Ⅱ与AT1受体结合，从而达到阻断动脉血管收缩，抑制交感神经兴奋，促进血压减低的作用^[1]。因作用机制新颖、疗效确切且副作用小，沙坦类药物在高血压药物市场占据着重要地位，具有广阔的开发前景^[2]。氯沙坦钾是首个ARB类药物，1994年率先在瑞典上市，在全球范围内作为治疗高血压的一线药物而广泛应用^[1]。

美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)于当地时间2019年3月1日，就其正在调查的多种通用ARB类药品的自愿召回事件发表公告。印度Hetero Labs Ltd.宣布召回87批氯沙坦钾片，涉及25 mg、50 mg和100 mg 3种规格。此次召回的由Hetero Labs制造并由Camber Pharmaceuticals销售的氯沙坦钾片中含有杂质N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA，结构式如图 1所示)，NMBA是已知的动物和潜在的人类致癌物质^[3]。此后，Torrent Pharmaceuticals、Vivimed Life Sciences Pvt Ltd、Teva Pharmaceuticals等制药公司又相继自愿召回涉及氯沙坦钾的200余批药品，其原因皆为NMBA含量超标^[4]。氯沙坦钾每日最高服用剂量为100 mg，NMBA每日最大阈值为96 ng，因此氯沙坦钾中NMBA的限度为0.96 ng·mg^-1[3]。液相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、分析速度快、结果准确可靠的特点，能够满足痕量毒性杂质测定的要求^[5]。本文采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)建立氯沙坦钾及其复方制剂中NMBA的测定方法，为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪，包括G7120A型二元泵，G7167B型进样器，G7116B型柱温箱，Agilent 6545 Q-TOF质谱仪(Agilent公司)；METTLER TOLEDO XP-205电子天平0.01 mg，(METTLER TOLEDO公司)；KQ-800KDE超声仪(中国昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

NMBA对照品(批号10-KMT-18-2，含量100.0%，Toronto Research Chemicals)；乙腈(色谱纯，批号177795)，甲酸(色谱纯，批号168642)均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；质谱所用调谐液、参比液均购自Agilent公司。氯沙坦钾片(批号R031531，规格100 mg)、氯沙坦钾片(批号S006544，规格50 mg)和氯沙坦钾氢氯噻嗪片(批号R036047，规格：氯沙坦钾50 mg/氢氯噻嗪12.5 mg)，杭州默沙东制药有限公司。

2 方法与结果 2.1 色谱及质谱条件 2.1.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱(0~2.5 min，95%A；2.5~3 min，95%A→10% A；3~8 min，10%A；8~8.5 min，10%A→95%A)；流速：0.3 mL·min^-1。

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；采集模式：正离子模式；扫描范围m/z：100~300。质谱检测时间为1~2.5 min。离子源参数：雾化气(N₂)压力：276 kPa；干燥器(N₂)：温度325 ℃，流速7 mL·min^-1；鞘气(N₂)：温度400 ℃，流速12 mL·min^-1；毛细管电压：4.0 kV；碎裂电压：75 V；锥孔电压：65 V。选择参比离子m/z 121.050 9实时校正。NMBA的提取离子为[M + H]⁺m/z 147.076 4，质量窗口为10 ×10^-6。

2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品储备液

精密称取NMBA对照品适量，用0.1%甲酸水溶液溶解，配制成每1 mL含1 μg NMBA的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液

取供试品10片，精密称定，研细，精密称取粉末适量(约相当于氯沙坦钾100 mg)，置10 mL量瓶中，加0.1%甲酸水溶液适量，超声(频率40 kHz，功率800 W)提取15 min，加0.1%甲酸水溶液定容至刻度，摇匀，取供试品溶液适量，13 000 r·min^-1离心5 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，即得。

2.3 线性和灵敏度

精密量取“2.2.1”项下NMBA对照品储备液适量，用0.1%甲酸水溶液分别稀释成5、10、25、50、100 ng·mL^-1的NMBA对照品溶液。对上述溶液分别进样，记录色谱图，以浓度(X，ng·mL^-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归。得线性方程：

$ Y=6 141.3X-1 654.2\;\;\;\;\;r=0.995 6 $

NMBA在5~100 ng·mL^-1浓度范围内线性良好。将对照品溶液逐级稀释，在信噪比(S/N)约为10.0时测得定量下限为2.1 ng·mL^-1，在S/N约为3.0时测得检测下限为1.0 ng·mL^-1(色谱图如图 2-C所示)。

2.4 精密度试验

取“2.3”项下10 ng·mL^-1的对照品溶液连续进样6次(色谱图如图 2-A所示)，测得NMBA峰面积的RSD(n=6)为6.4%，说明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取批号为R031531的样品粉末(约相当于氯沙坦钾100 mg)，置于10 mL量瓶中，精密加入“2.3”项下100 ng·mL^-1的对照品溶液1 mL，按“2.2.2”项下方法操作，平行制备6份，进样分析，记录色谱图(如图 2-B所示)，NMBA浓度的RSD(n=6)为9.8%，表明方法的重复性良好。

2.6 回收率试验

精密称取批号为R031531的样品粉末(约相当于氯沙坦钾100 mg，色谱图如图 2-A所示)9份，分别置10 mL量瓶中，精密加入NMBA对照品溶液，按“2.2.2”项下方法操作，即得NMBA质量浓度分别为5.15、51.5、103 ng·mL^-1的供试溶液各3份，进样测定，计算平均回收率(n=9)为89.2%，RSD为4.4%。

2.7 稳定性试验

取1份重复性试验供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12 h进样测定，计算NMBA峰面积的RSD(n=6)为7.6%，说明NMBA供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 样品测定

用所建立的方法对3批样品进行测定，3批样品均未检出NMBA。

3 讨论

基因毒性杂质是指能直接或间接损害DNA，从而引起基因突变或致癌的物质^[6]。NMBA因具有烷基亚硝胺结构而具有基因毒性^[7]。基因毒性杂质的含量很低(μg·mL^-1或μg·g^-1)，对其进行分析检测不仅要有较高的灵敏度，还要求较好的特异性^[8]。FDA目前已发布测定沙坦类药物中NMBA含量的RapidFire-MS/MS^[9]和LC-Q-Orbitrap-MS^[10] 2种方法。本文采用LC-Q-TOF-MS建立氯沙坦钾及其复方制剂中NMBA的含量测定方法，对其质量控制方法进行扩充并提供参考。

3.1 色谱条件和质谱条件的优化

根据NMBA的结构特点，正离子采集模式和负离子采集模式皆可选用，经比较发现，正离子采集模式下NMBA的响应更好。实验进一步考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈对NMBA响应的影响，发现0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相NMBA的灵敏度更好。供试品溶液中氯沙坦钾(t_R=3.82 min)的浓度高达10 mg·mL^-1，经实验优化，质谱采集时间设定为1~2.5 min，氯沙坦钾经液相洗脱后可直接从废液管排出，以避免对质谱的污染。

3.2 提取溶剂优化

NMBA对照品采用甲醇、乙腈等有机溶剂溶解后，NMBA的质谱响应差，灵敏度受有机溶剂影响很大，所以实验采用水溶液作为对照品溶解及供试品提取溶剂；为了最大限度减少[M+Na]⁺和[M+K]⁺ 2种离子，增加[M+H]⁺的灵敏度，经优化，最终选择0.1%甲酸水溶液作为提取溶剂。

3.3 方法的局限性

NMBA等亚硝胺类杂质是在原料药生产过程中，由特定的工艺步骤和化学反应形成的。制剂除原料药外还含有多种辅料，基质相对原料药复杂，故本文所建立方法对测定干扰相对较小的原料药及中间体同样适用。后续可使用该方法进一步对不同厂家原料药及制剂生产的整个过程进行控制，并追溯其产生的原因，以更好地控制氯沙坦钾等血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物的质量。