2019, Vol. 39 
2. 长春百克生物科技股份公司研发部, 长春 130012
2. Research and Development Department of Changchun Baike Biotechnology Co., Ltd., Changchun 130012, China
流行性感冒简称流感，是流感病毒引起的急性呼吸道感染性疾病[1]，具有高发病率和高死亡率的特性，给人类健康和社会经济带来了巨大的负担[2]，每年注射流感疫苗是降低流感感染的最有效手段。目前上市的流感疫苗有2种：流感灭活疫苗(inactivated influenza vaccine，IIV)和流感减毒活疫苗(live attenuated influenza vaccine，LAIV)。LAIV通过鼻腔接种，模拟病毒自然感染，在鼻粘膜局部诱导产生分泌型IgA抗体[3]，从而在流感病毒首次侵入人体的物理位置直接提供第一线防护，然后再激发潜在的系统性细胞免疫和抗体反应[4-7]。LAIV针对同型流感病毒，为成人和儿童提供了与IIV相似的保护率[8]，甚至对异型流感病毒产生交叉保护作用[9]。血凝抑制试验(hemagglutination inhibition，HI)是评价灭活流感疫苗的重要指标，血凝效价大于1:40被认为与季节性流感疫苗保护作用相关，但是相比IIV，接种LAIV产生较低的HI抗体滴度和阳转率[10]。有研究表明，接种LAIV后鼻粘膜的IgA抗体在抵御流感病毒的感染中发挥重要作用[11]。本研究对本实验室建立的鼻炎拭子IgA酶联免疫吸附试验(IgA-ELISA)进行验证，并初步应用于国产LAIV疫苗免疫效果的评价。
1 材料和方法 1.1 抗原和鼻咽拭子样本H1N1 (A/California/7/2009)、H3N2 (A/Switzerland/9715293/2013)及B(B/Phuket/3073/2013)抗原购自英国生物制品所；鼻咽拭子样品来自接种长春百克生物科技股份公司研制的LAIV疫苗志愿者。
1.2 主要试剂和仪器辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗人IgA二抗购自Sigma公司；酶标板为Corning公司产品；TMB显色液购自KPL公司；鼻咽拭子样本保存液购自友康恒业生物科技(北京)有限公司。吐温20购自Sigma公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自AMRESCO公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；酶标仪(Multiskan Ascent)购自Thermo公司。
1.3 IgA检测方法用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释H1N1、H3N2及B抗原至0.5 μg·mL-1，100 μL·孔-1加入酶标板，置4 ℃包被过夜；用含有0.05% Tween 20的PBS(PBST)洗板3次，加入含1% BSA的PBS封闭液，37 ℃封闭2 h；洗板3次，使用含有2%脱脂奶粉的PBST将样本做1:4，1:8，1:16，1:32倍稀释，按每孔100 μL加至ELISA板中，空白对照为样品稀释液，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每孔加入100 μL辣根过氧化酶标记的羊抗人IgA抗体(1:4 000)，10 000·孔-1，37 ℃孵育1 h；用PBST洗涤5次，加入TMB显色液，100 μL·孔-1，25 ℃孵育30 min；加入50 μL 1 mol·L-1硫酸终止反应，酶标仪检测A450。滴度结果判定：样本A≥空白对照的平均A的2倍则判为阳性，样本呈阳性的最高稀释度即为该样品IgA抗体滴度。
1.4 HI试验0.1 mL待检血清预先加入0.4 mL霍乱滤液，37 ℃处理16 h后，以鸡血球吸附过夜，取上清进行试验，血清滴度以稀释倍数倒数表示。血清起始稀释倍数为1:5，起始倍数为阴性时，按惯例判定HI滴度为2.5。
1.5 特异性分析流感病毒H1N1、H3N2和B型IgA抗体阳性鼻咽拭子样品各1份检测，分别进行2倍系列稀释，共设置8个稀释度，测定A450，计算样本的IgA抗体滴度，用以考察该方法的特异性。
1.6 精密性分析多次平行检测不同型流感病毒IgA抗体阳性样本，考察该方法的重复性。
1.7 初步应用收集长春百克生物科技股份公司研发的鼻喷冻干LAIVⅡ期临床试验中3~17岁本年度未接种过流感疫苗的志愿者血清样本，接种LAIV前和接种31 d后鼻咽拭子样本采用IgA EIISA检测IgA抗体，采用HI方法对收集的血清样本检测HI抗体。
2 结果 2.1 IgA-ELISA的特异性如图 1-A所示，H1N1病毒的剂量反应曲线显示H1N1型阳性样品具有较高的IgA抗体滴度，抗体滴度为16，而H3N2和B型IgA抗体阳性样本抗体滴度为阴性，滴度小于或者等于2；H3N2病毒的剂量反应曲线显示针对H3N2抗原H3N2型阳性样品抗体滴度为8，而H1N1和B型阳性样品抗体滴度均为滴度小于或者等于2，为阴性(如图 1-B)。B型作为包被抗原，结果类似。B型阳性样品抗体滴度为8，其他两型抗体滴度均为阴性(如图 1-C)。
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A. H1N1型病毒的剂量反应曲线(the dose response of H1N1 virus) B. H3N2型病毒的剂量反应曲线(the dose response of H3N2 virus) C. B型病毒的剂量反应曲线(the dose response of B virus) 图 1 IgA-ELISA方法的特异性 Fig.1 Specifity of IgA-ELISA method |
用同一批抗原包被ELISA板，按照已确定的ELISA方法，对不同型别流感病毒的高低浓度各2份鼻咽拭子样本进行检测，每个样品做5次独立重复试验，根据检测样本的A450，计算组内重复性试验的5次平行试验结果的RSD在3.3%~10.9%，平均值为6.9%，同一样本不同工作日的RSD为7.5%~9.8%，平均值为8.3%，结果见表 1。组内重复性中样品1的H1N1、H3N2和B型IgA抗体滴度几何均值为1:32，1:32和1:16，RSD均为0；组间重复性样品1的3种型别流感病毒IgA抗体滴度几何均值分别为1:32，1:32和1:16，RSD均为0。
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表 1 精密性试验结果(A450，n=5) Tab.1 Results of precision test |
用该方法检测鼻咽拭子样品1 052份，其中滴鼻接种LAIV免疫前和免疫后样本各351份，注射生理盐水安慰剂接种前和接种后样本各175份。检测结果见表 2。疫苗组H1N1、H3N2以及B型IgA抗体几何平均滴度(GMT)接种前后的比值分别为1.15，1.45和1.18，均高于安慰剂组；疫苗接种组IgA抗体滴度高于免疫前2倍的比率(IgA抗体反应率)，也高于安慰剂对照组，但是H1N1 IgA反应率疫苗组与安慰剂组相比无统计学差异(X2=2.192，P=0.139)，H3N2型与B型IgA抗体反应率疫苗组与安慰剂组有明显统计学差异(H1N1：X2=15.303，P=0.000；B：X2=7.177，P=0.007)。疫苗组H3N2型HI抗体接种后滴度大于接种前4倍(HI抗体阳转率)的受试者比率是12.25%，而安慰剂组比率是2.29%，具有统计学差异(X2=14.251，P=0.000)，H1N1和B型HI抗体阳转率疫苗组和安慰剂组相比均无统计学差异(H1N1：P=0.351；B：P=0.144)。疫苗组中H1N1型IgA抗体增长2倍的受试者中只有3% HI抗体滴度也大于4倍；H3N2 IgA反应阳性的受试者仅有23% HI抗体阳转，B型IgA抗体反应阳性的受试者中12%HI抗体阳转。IgA抗体检测结果与血清样本HI抗体结果缺乏相关性(P < 0.001)。
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表 2 接种LAIV免疫前后HI和IgA抗体结果 Tab.2 The results of influenza HI and IgA antibodies after and before inoculation with LAIV |
LAIV通过鼻腔接种，模拟流感病毒自然感染，首先在上呼吸道粘膜诱导分泌型IgA抗体[12]，从而形成机体防卫的第一道防线，接种LAIV诱导产生的IgA抗体在疫苗对流感病毒的保护中发挥重要作用。本研究对建立的针对不用流感亚型特异的IgA抗体检测方法进行方法学性能验证，使用来自英国生物制品所的国家参考品作为包被抗原，检测不同流感型别IgA抗体鼻咽拭子阳性样品。结果显示，只有针对包被抗原阳性的样品检测到高滴度的IgA抗体，其他型别的抗体未检测到，方法特异性显著。通过对2个不同抗体滴度水平的阳性样品多次重复检测，根据吸收度计算的RSD均在11%以内，抗体滴度没有变化，计算的RSD为0，方法具有较好的重复性。
2003年美国Medimmune公司成功研发出全球第一支LAIV并上市，2012年四价LAIV被美国食品药品监督管理批准用于2~49岁健康人群以预防季节性流感。10多年的使用证明LAIV在成人中的保护效果比TIV差[13]，但是在6月龄~18岁儿童中的保护作用优于TIV[14-16]。国外文献报道LAIV在2~17岁儿童中对流感的保护率在78%~87%之间[9]。在2014年6月，美国免疫接种咨询委员会(Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP)建议在2~8岁儿童中使用LAIV[17]。TIV采用肌肉注射，产生的系统性IgG抗体通过经典的HI评价，HI抗体滴度≥体滴被认为具有保护作用。与TIV的保护机制不用，LAIV通过鼻腔接种，主要是在局部产生粘膜IgA抗体而不是系统性IgG抗体发挥作用[18]。本文实验结果显示，检测接种LAIV后31 d H3N2型和B型IgA抗体滴度升高2倍的人分别为136人和109人，占疫苗接种者38.75%和人31.05%，显著高于基于HI抗体计算的阳转率。H1N1 IgA反应率疫苗组与安慰剂组无统计学差异，与近年来文献报道的一致，目前没有明确的原因，可能与H1N1流行株的特点以及疫苗的组成等因素有关[20]。针对2~3岁儿童接种LAIV IgA抗体的分析报道中指出[19]，针对H1N1型接种LAIV疫苗的IgA抗体阳性率在26%~39%，安慰剂组IgA抗体阳性率在12%~30%。H3N2型IgA抗体阳性率在33%~48%，安慰剂组在20%~27%。B型IgA抗体阳性率在46%~59%，安慰剂组在14%~38%。H1N1和H3N2的结果均在国外文献报道范围内。B型疫苗组IgA抗体阳性率31.05%，低于文献报道，可能与当年B型流行范围有关。此外，结果显示疫苗组中IgA抗体增长2倍的受试者中只有3%~23%的HI抗体滴度大于4倍。IgA抗体检测结果与血清样本HI抗体结果缺乏相关性(P > 0.05)。与国外报道一致，不同于IIV，接种LAIV后鼻粘膜的IgA抗体可为儿童抵御流感病毒的感染提供有效保护[21]。综上所述，本文建立的IgA-ELISA检测方法特异强，重复性好，操作简便，为LAIV疫苗效果评价以及后续免疫程序的优化奠定了基础。
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