淫羊藿(Epimedii Folium)，别名仙灵脾，首次记载于《神农本草经》，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效。2015年版《中华人民共和国药典》规定，中药淫羊藿的4种基源植物为小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicomu Maxim.)、箭叶淫羊藿(E. sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(E. pubescens Maxim.)、朝鲜淫羊藿(E.koreanum Nakai)^[1]。其中朝鲜淫羊藿主要分布在吉林省与辽宁省，黑龙江省与吉林省交界处也有少量分布，其分布范围北至黑龙江省宁安市，南至辽宁省凤城市，西至辽宁省抚顺市，东至吉林省珲春市，分布地域狭窄，种群更新的能力较弱^[2]。朝鲜淫羊藿主要依赖野生资源，由于市场需求增加及不合理的采收，目前野生资源接近枯竭^[3]。

现有研究表明，影响中药质量的因素有品种^[4-5]、产地^[6]、采收时间^[7]、干燥方法^[8]等。研究表明，以淫羊藿苷为指标，不同产地朝鲜淫羊藿的合格率只有38%，朝鲜淫羊藿的质量问题比较突出。从现有的文献报道来看，关于朝鲜淫羊藿的质量影响因子研究主要有生长年限^[9]、光照^[10]、采收期^[11]、药用部位^[12]、炮制方法^[13]、海拔^[14]，因此，从道地药材的角度出发，探讨产地因子对朝鲜淫羊藿质量的影响情况。本文在朝鲜淫羊藿的全部适生区内采集野生样品，对其质量进行评价与分析，明确目前朝鲜淫羊藿使用中存在的问题，并为今后朝鲜淫羊藿的质量提升及栽培选地提供科学依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Tu-1810型紫外可见分光光度计(深圳市亿鑫仪器设备有限公司)；Essentia SPD-15C型高效液相色谱仪(岛津公司，包括二元液相泵、柱温箱、手动进样器、紫外检测器、LC solution 15C工作站)；KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DE-300 g粉碎机(浙江红景天工贸有限公司)；Milli-Q Direct 8超纯水机(默克化工技术有限公司)；AP124X万分之一电子天平(岛津公司)。

1.2 试剂与药品

甲醇、乙腈均为色谱纯(赛默飞世尔科技有限公司)，乙醇为分析纯(北京化工厂); 对照品：淫羊藿苷(批号110737-201516，含量≧98%)购自中国食品药品检定研究院，朝藿定A(HPLC≧98%)、朝藿定B(HPLC≧98%)、朝藿定C(HPLC≧98%)均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 药材

朝鲜淫羊藿药材样品均为实地采集于吉林省临江市、集安市、通化市、白山市和辽宁省桓仁满族自治县、宽甸满族自治县，采集时间为2018年6月25日~8月10日，由长春中医药大学药学院姜大成教授鉴定为小檗科植物朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)的干燥叶。

2 方法与结果 2.1 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的含量测定 2.1.1 对照品混合溶液的制备

精密称取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的对照品适量，加甲醇制成含淫羊藿苷0.105 mg·mL^-1、朝藿定A 0.106 mg·mL^-1、朝藿定B 0.101 mg·mL^-1、朝藿定C 0.108 mg·mL^-1的混合溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备

取全部过3号筛的朝鲜淫羊藿粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称量，超声(500 W，40 kHz)处理1 h，再称量，用稀乙醇补足减失的量，摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.1.3 色谱条件

色谱柱：Inertsil^®ODS-3 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈(B)-水(A)，梯度洗脱(0~37 min，24%B；37~47 min，24%B→38%B；47~60 min，38%B→24%B)；流速：1 mL·min-1;检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按淫羊藿苷计算不低于1 500。色谱图见图 1。

2.1.4 线性关系考察

按照上述色谱条件，取对照品混合溶液2、4、6、8、10、12 μL注入仪器，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得4个黄酮成分的标准曲线方程及其线性范围。见表 1。

2.1.5 精密度试验

精密吸取混合对照品5 μL，连续进样6次，记录峰面积。计算得淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C峰面积的RSD分别为1.0%、1.2%、1.1%和1.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

精密吸取朝鲜淫羊藿(样品1)供试品10 μL，室温下分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，记录峰面积。计算朝鲜淫羊藿中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C峰面积的RSD(n=6)分别为1.7%、1.6%、1.1%和1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

称取样品粉末6份各约0.2 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积，计算淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量的平均值分别为0.47%、0.20%、0.14%、0.32%，RSD分别为1.3%、2.0%、0.93%和2.0%，表明该方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密称取样品粉末6份，分别精密加入一定量的4种对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定峰面积，计算各成分的加样回收率及RSD。结果淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的平均回收率(n=6)分别为100.5%、100.5%、100.8%、100.5%，RSD分别为0.77%、0.59%、0.72%和0.67%，表明该方法加样回收试验结果良好。

2.1.9 样品测定

取20批朝鲜淫羊藿，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定4个黄酮化合物的含量，结果见表 2。

2.2 总黄酮含量测定^[1] 2.2.1 对照品储备液制备

精密称取淫羊藿苷对照品1.03 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，得淫羊藿苷的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取“2.1.2”项下续滤液0.5 mL，加甲醇定容于50 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.2.3 标准曲线的绘制

精密吸取淫羊藿苷对照品储备液0.2、0.4、0.8、1、1.6、2 mL，加甲醇定容于10 mL量瓶中，得质量浓度为2.06、4.12、8.24、10.30、16.48、20.60 μg·mL^-1的系列对照品溶液。以吸收度Y为纵坐标，淫羊藿苷质量浓度(X，μg·mL^-1)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：

$ Y=0.051 2X-0.014 3\;\;\;r= 0.999 9 $

线性范围在2.06~20.60 μg·mL^-1之间。

2.2.4 样品测定

取“2.2.2”项下供试品溶液，以甲醇为空白溶剂，置紫外分光光度计中，于270 nm波长处测定吸收度，连续测定3次求其平均值，将得到的吸收度带入线性方程，计算各个产地样品中总黄酮的百分含量。测定结果见表 2。

2.3 结果与分析 2.3.1 朝鲜淫羊藿中黄酮成分的分布规律

从现有的20份朝鲜淫羊藿样品的测定结果来看，4个黄酮成分在朝鲜淫羊藿中全部存在，淫羊藿苷含量相对较高，朝藿定A与朝藿定C含量水平相当，朝藿定B含量相对较低。除EK-2、EK-3、EK-19产地样品朝藿定B含量(0.22%、0.12%、0.37%)高于朝藿定C含量(0.18%、0.11%、0.35%)，EK-5和EK-9产地样品朝藿定C含量(0.14%、0.20%)与朝藿定A含量(0.14%、0.20%)相等外，其余产地样品的含量测定结果都遵循淫羊藿苷 > 朝藿定C > 朝藿定A > 朝藿定B这一规律。

2.3.2 不同产地样品间黄酮成分含量差异

通过对表 2数据的整体分析，朝鲜淫羊藿中黄酮成分含量较为丰富，不同产地之间黄酮成分含量差异较大，总黄酮含量范围为2.49%~8.06%(相差3.24倍)，淫羊藿苷含量范围为0.24%~0.63%(相差2.63倍)，朝藿定A含量范围为0.07%~0.32%(相差4.57倍)，朝藿定B含量范围为0.06%~0.37%(相差6.17倍)，朝藿定C含量范围为0.11%~0.35%(相差3.18倍)。20个产地朝鲜淫羊藿样品中总黄酮含量符合2015年版《中华人民共和国药典》的有11个，合格率为55%；淫羊藿苷含量符合2015年版《中华人民共和国药典》的有2个，合格率为10%。其中EK-16和EK-19产地样品中总黄酮与淫羊藿苷含量较高，超过2015年版《中华人民共和国药典》标准，总体质量优于其他产地样品。

2.3.3 聚类分析

将表 2数据导入IBM SPSS Statistics 22软件，进行Q型聚类与R型聚类。Q型聚类方法为最远邻元素法，类间距离的计算采用欧式平方距离法；R型聚类方法为最远邻元素法，类间距离的计算采用Pearson法。

Q型聚类：采用该聚类方法可以较好地对20份样品进行分类。由图 2可知，当欧氏平方距离为10时，可将样品聚为2类：其中EK-1、EK-2、EK-3、EK-4、EK-5、EK-6、EK-10、EK-12、EK-17聚为1类，其余样品聚为1类；在此基础上，当欧式平方距离为6时，可将样品聚为3类：EK-16、EK-18、EK-19聚为1类，EK-1、EK-2、EK-3、EK-4、EK-5、EK-6、EK-10、EK-12、EK-17聚为1类，其余聚为1类；当欧式平方距离为3时，可将样品聚为4类：EK-1、EK-4、EK-10聚为1类，EK-16、EK-18、EK-19聚为1类，EK-7、EK-8、EK-9、EK-11、EK-13、EK-14、EK-15、EK-20聚为1类，其余聚为1类。

R型聚类：指标聚类结果表明，可将检测的5个指标聚为3类，总黄酮与朝藿定B各聚为1类，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定C聚为1类。

3 讨论 3.1 不同产区样品黄酮成分的对比分析

通过对东北地区20个不同产区的朝鲜淫羊藿药材样品进行黄酮成分的含量测定发现，在吉林省和辽宁省分布的药材内在质量存在差异。从现有的样品及测定结果来看，有11个产地的药材样品总黄酮含量符合2015年版《中华人民共和国药典》规定，其中含量最高的为辽宁省桓仁县二棚甸子镇所采集的样品(8.06 %)，总黄酮含量排在前三的均分布在辽宁省桓仁县；有2个产地样品淫羊藿苷含量符合《中华人民共和国药典》规定，分别为辽宁省桓仁县五女山(0.58%)和二棚甸子镇(0.63%)。聚类分析结果也表明，产于辽宁省桓仁县的朝鲜淫羊藿可聚为1类，产于吉林省临江市的朝鲜淫羊藿可聚为1类，通过以上分析可以初步判定，辽宁省桓仁县产朝鲜淫羊藿质量相对其他地区较好。

3.2 不同产区样品内在质量产生差异的原因

综上所述，20批朝鲜淫羊藿样品中总黄酮合格率为55%，淫羊藿苷合格率为10%，与文献报道东北地区朝鲜淫羊藿含量测定不合格率较高等问题一致^[15]。辽宁省所产朝鲜淫羊藿黄酮成分含量相对吉林省较高，徐翔等^[16]利用最大熵模型分析朝鲜淫羊藿的分布数据及生态因子数据，认为朝鲜淫羊藿的高适生区并不在产量较高的吉林省长白山区，而在辽宁省东部，本文结论与文献报道一致，由此也证明，不同产地由于气候等环境的变化确实影响药材的内在质量。吉林省临江市地处鸭绿江畔，年平均降水量在800~1 000 mm，气候较辽宁省桓仁县更加湿润，朝鲜淫羊藿内在质量波动较大，与王哲等^[17]认为影响朝鲜淫羊藿分布的显著生态因子为降水量的观点一致，也与宋代《嘉佑本草》记载的淫羊藿“生处不闻水声者良”的记载相符。