紫斑牡丹(Paeonia rockii)为毛茛科芍药属多年生木本植物^[1]，分布于四川北部、甘肃南部、陕西秦岭中段以西，也是仅次于中原牡丹品种群的第二大品种，因其花瓣基部有一个明显紫斑而得名^[2]。紫斑牡丹除了被用于园林建设、城市绿化，其种子和丹凤牡丹(Paeonia ostii T.H ong et J.X. Zhang)的种子业已成为新资源食品牡丹籽油的原料；据甘肃省卫生厅1996年颁布的《第四批24种中药材质量标准(试行)》通知，其根皮作为药用牡丹皮被甘肃省中药材标准收载。近几年有关紫斑牡丹的研究主要集中于紫斑牡丹的生物学、生药学及采集加工等^[3]，另有基于网络药理学的方法对紫斑牡丹花及叶的抗菌活性和作用机制的初探^[4]，以及紫斑牡丹籽饼粕中单萜苷类及低聚芪类成分的分离鉴定^[5-6]，而对于紫斑牡丹花粉的研究报道甚少，其中主要为初步探索性研究^[7-12]，包括紫斑牡丹花粉中营养成分氨基酸、脂肪酸的含量测定，紫斑牡丹花粉抗氧化性能的评价，以及紫斑牡丹花粉中槲皮素、木犀草素和异鼠李素含量测定和总黄酮的提取工艺优化。为了开发利用紫斑牡丹花粉，本文通过HPLC法建立紫斑牡丹花粉的特征图谱，并对氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素4个成分进行含量测定，希望为其质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪(包括四元泵、DAD检测器、自动进样器及Empower工作站)，SBL-10DT超声波恒温清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，MS205DU型十万分之一分析天平(瑞士Mettle Toledo公司)，Milli-Q IQ 7000超纯水系统(德国默克密理博公司)。

1.2 试药

对照品氧化芍药苷(批号Q-019-180330)、芍药内酯苷(批号S-011-170908)，HPLC法测得纯度均 > 98%，由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；对照品芍药苷(批号110736-201741，纯度95.7%)、槲皮素(批号100081-201610，纯度99.1%)均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈为色谱纯，水为Milli-Q超纯水，其他试剂为分析纯。

13批紫斑牡丹花粉样品分别采自兰州新区(S1~S5，S8~S13)、安徽亳州(S6)、山东菏泽(S7)，原植物经兰州中川牡丹产业有限公司赵潜龙高级工程师鉴定为毛茛科芍药属植物紫斑牡丹[Paeonia rockii(S.G.Haw.et.Laeuner)T.Hang et.T.J.Li]。

2 溶液的制备 2.1 混合对照品储备液

精密称取对照品氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素适量，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制上述4个成分质量浓度分别为1.515、1.610、1.216、6.968 mg·mL^-1的混合对照品储备液，备用。

2.2 供试品溶液

精密称定紫斑牡丹花粉0.25 g，置于150 mL锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50 mL，称量，超声(功率360 W，频率40 kHz)提取1 h，静置放冷后再次称量，用50%乙醇水溶液补足减失的量，用0.2 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3 色谱条件

采用CAPCELL PAK-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.2%甲酸水(B)为流动相进行梯度洗脱(0~3 min，10%A→12%A；3~10 min，12%A→16%A；10~15 min，16%A→18%A；15~18 min，18%A→28%A；18~25 min，28%A→31%A；25~35 min，31%A→32%A；35~45 min，32%A→34%A；45~50 min，34%A→40%A；50~51 min，40%A→90%A；51~52 min，90%A；52~53 min，90%A→10%A；53~54 min，10%A)，流速1 mL·min^-1，检测波长274 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

4 特征图谱 4.1 紫斑牡丹花粉特征图谱的建立

精密称取编号S1~S13的紫斑牡丹花粉各0.25 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件进样测定，记录各样品的色谱峰，导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)，设定编号S1样品的色谱图为参照图谱，其余编号样品色谱峰与之匹配，生成紫斑牡丹花粉的对照特征图谱和13批紫斑牡丹花粉样品特征图谱的匹配图，见图 1、2。

4.2 方法学考察 4.2.1 精密度试验

精密称取编号为S5的紫斑牡丹花粉0.25 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件连续进样6次进行测定，记录色谱图，用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(20012版)进行分析，计算得色谱图之间的相似度为1，符合中药特征图谱的要求。计算峰面积，测得各批次样品所共有的4个成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.93%、1.4%、2.6%、0.72%，表明仪器精密度良好。

4.2.2 稳定性试验

精密称取编号为S5的紫斑牡丹花粉0.25 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录色谱峰，用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)进行分析，计算得色谱图之间的相似度为1，符合中药特征图谱的要求。计算峰面积，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.7%、2.0%、2.0%、2.4%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

4.2.3 重复性试验

精密称取编号为S5的紫斑牡丹花粉0.25 g，平行6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰，用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)进行分析，计算得色谱图之间的相似度为1，符合中药特征图谱的要求。计算峰面积，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.6%、1.9%、2.4%、0.75%，表明此方法重复性良好。

4.3 特征图谱结果分析

根据13批样品的特征图谱分析结果，紫斑牡丹花粉中主要有16个共有峰，指认出4个色谱峰，分别为氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素，其保留时间依次为9.591、15.113、17.028、31.102 min。利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)进行分析，计算13批紫斑牡丹花粉(S1~S13)与对照特征图谱的相似度，依样品编号顺序分别为0.969、0.979、0.988、0.980、0.995、0.991、0.984、0.970、0.982、0.988、0.985、0.995、0.997，提示13批紫斑牡丹花粉与对照特征图谱相似度较好。

5 紫斑牡丹花粉中4个成分的含量测定 5.1 系统适用性试验

精密吸取“2.1”项下混合对照品储备液1.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，配制成混合对照品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液和编号为S5的紫斑牡丹花粉供试品溶液各10 μL，按“3”项下色谱条件进样测定，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素4个目标测定峰与其相邻色谱峰的分离度 > 1.5，理论塔板数以氧化芍药苷峰计大于7 000，色谱图见图 3。

5.2 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备液0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mL，分别置10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，配制成系列浓度的混合对照品溶液，按照“3”项下色谱条件分别进样10 μL，测定峰面积。以对照品溶液的浓度(X，μg·mL^-1)为横坐标，对照品溶液中各成分的峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，见表 1。

5.3 检测下限与定量下限

取混合对照品储备液适量，用甲醇逐级稀释成系列梯度浓度溶液并进样分析，测定峰面积约为噪声3倍(S/N=3)时的进样量为检测下限(LOD)，峰面积约为噪声10倍(S/N=10)时的进样量为定量下限(LOQ)。结果氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素的检测下限和定量下限分别为0.010、0.090、0.097、0.006 μg和0.032、0.166、0.159、0.019 μg。

5.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液(含氧化芍药苷37.12 μg·mL^-1、芍药内酯苷39.45 μg·mL^-1、芍药苷29.09 μg·mL^-1、槲皮素172.63 μg·mL^-1)10 μL，依“3”项下色谱条件连续进样6次，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素峰面积的RSD分别为1.1%、2.3%、2.3%、1.0%，表明仪器精密度良好。

5.5 稳定性试验

精密称取编号为S5的紫斑牡丹花粉0.25 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件分别在0、4、8、12、24 h进样测定，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素峰面积的RSD分别为0.71%、2.3%、0.83%、0.66%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

5.6 重复性试验

精密称取编号为S5的紫斑牡丹花粉0.25 g，平行6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件进样测定，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素的平均含量分别为2.92、8.27、10.59、13.76 mg·g^-1，RSD分别为1.1%、2.3%、1.5%、0.55%，表明此方法重复性良好。

5.7 加样回收率试验

精密称取编号为S5的紫斑牡丹花粉0.125 g，平行6份，置锥形瓶中，精密加入氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素的对照品适量，按“2.2”项下方法制备供试溶液，分别精密吸取10 μL，按“3”项下色谱条件进样测定，结果见表 2。

5.8 含量测定

精密称取7批紫斑牡丹花粉0.25 g，平行3份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定。并用回归方程计算紫斑牡丹花粉中4个成分的含量，结果见表 3。

6 讨论 6.1 流动相的选择

本试验考察不同的流动相系统甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水的分离效果，初选出乙腈-甲酸水作为流动相；通过优化确定乙腈-0.2%甲酸水为流动相，梯度洗脱55 min，各峰均能达到较好分离，峰形对称，试验结果理想。

6.2 检测波长的选择

本试验在相同色谱条件下，考察了文献报道的检测波长230 nm^[13]、265 nm^[14]、270 nm^[15]以及本文通过190~400 nm扫描确定的检测波长274 nm，发现在274 nm条件下，色谱峰信息较全面，4个目标测定成分均有吸收且分离度较好，故选择274 nm作为检测波长。

6.3 供试品溶液制备方法的选择

通过比较回流、超声2种提取方法发现，超声提取效率高、时间短。以氧化芍药苷、芍药苷、槲皮素的峰面积为指标，选择不同浓度的甲醇、乙醇作为提取溶剂，并设置不同提取时间(0.5、1、1.5、2 h)，遴选得到50%乙醇溶液为溶剂，超声提取1 h作为试验供试品溶液的制备方法。

6.4 特征图谱分析

通过特征图谱的比较，确立13批紫斑牡丹花粉色谱图中有16个共有峰；采用与对照品比较的方法，确定了其中4个峰的归属，氧化芍药苷、芍药苷、槲皮素3个成分的色谱峰在各批次样品中均能检出，而芍药内酯苷的色谱峰在S6、S7 2个分别产自安徽亳州、山东菏泽的样品中未检出。虽然各批次样品有差异，但13批样品色谱图与特征图谱相似度均在0.9以上，说明各色谱峰之间规律性较强，可作为紫斑牡丹花粉质量控制和含量测定方法。

6.5 含量测定结果分析

通过对产自甘肃兰州的5批紫斑牡丹花粉(S1~S5)和产自安徽亳州、山东菏泽的紫斑牡丹花粉(S6、S7)中氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素的含量测定发现，各批次样品中均含有氧化芍药苷、芍药苷、槲皮素，含量分别在2.488~7.675 mg·g^-1、2.339~10.433 mg·g^-1、6.462~15.924 mg·g^-1之间，而芍药内酯苷在产自甘肃兰州的S2、S4号样品中含量较低，在产自安徽亳州的S6号、山东菏泽的S7号样品中未检出，此结果是否与花粉采集、储存关联，有待进一步的研究。

6.6 小结

本文采用HPLC法建立了紫斑牡丹花粉的指纹图谱，其分离度和重复性良好，能够较好地反映紫斑牡丹花粉中化学成分的特征；同时建立了氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、槲皮素的含量测定方法，为紫斑牡丹花粉的质量控制及深入研究奠定了基础。