地龙是常用动物类药材，来源于钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体，前1种习称“广地龙”，后3种习称“沪地龙”^[1]。地龙具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效，用于高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、水肿尿少^[1-2]，主要含有蛋白质和多肽、酶类、氨基酸、核苷酸、微量元素等成分^[3-8]。

广地龙因个大，质佳，是地龙药材市场的主流品种，而我国蚯蚓品种多，形态相似，因此广地龙药材品种来源复杂，真伪鉴别难度大，在其真伪鉴别方面现多采用DNA分子鉴定技术，鉴定结果准确可靠^[9-11]。研究表明，市售广地龙药材中大腔蚓(Metaphire magna)和暗孔远盲蚓(Amynthas obscuritoporus)为广地龙药材最常见的2种伪品^[12]，而广地龙饮片及其伪品中所含核苷类成分的特征图谱及含量差异研究未见报道。本文收集不同地区的广地龙饮片，建立核苷类成分HPLC特征图谱并比较不同品种特征图谱的差异，以尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷为指标成分，建立了同时测定5个指标成分的高效液相色谱法，并比较了5个核苷类成分在广地龙(参环毛蚓)及其伪品中的含量差异，为广地龙饮片的真伪鉴别和质量监控提供实验依据。

1 仪器、试药及样品 1.1 仪器

东胜龙ETC811 PCR仪(北京东胜创新生物科技有限公司)；Julabo TW20恒温水浴箱(德国Julabo公司)；76S/06983凝胶成像仪(BioRad中国公司)；KQ5200DE超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；AX223ZH分析天平(美国奥豪斯公司)；DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)；H1650W小型台式离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；DS-11超微量紫外/可见分光光度计(美国丹诺尔公司)；SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Thermo Ultimate 3000液相色谱仪(赛默飞公司)，包括DAD检测器、四元低压梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱。

1.2 试药

PrimeSTAR^® Max DNA Polymerase、100 bp DNA Buffer、DNA Loading Buffer，宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；动物基因组DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker，北京擎科新业生物技术有限公司；GelRed^TM，美国Biotium公司；尿嘧啶(批号N-024-121228)、次黄嘌呤(批号C-069-160412)、黄嘌呤(批号N-024-121228)、腺苷(批号N-024-121228)、肌苷(批号N-024-121228)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均达到98%以上；流动相所用甲醇、甲酸为色谱纯，实验用水为纯净水(华润怡宝食品饮料有限公司)，其他试剂均为分析纯。

1.3 样品

广地龙饮片于2018年4~7月份购自广东、广西，浙江、河南、北京、山西、陕西、江西、湖北等地药店，共收集41批，采用聚合酶链式反应法^[9-11]，利用16S rRNA基因序列^[13]对各批地龙饮片进行分子鉴定，经暨南大学药学院马志国副教授鉴定，分别为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E. Perrier)、大腔蚓Metaphire magna(Chen)和暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus(Chen)的干燥体^[12]，具体鉴定结果见表 1。

2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液

精密称取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤的对照品适量，分别置10 mL量瓶中，用0.1%氨水溶解并稀释至刻度，混匀，配制成质量浓度分别为170、220、250 μg·mL^-1的溶液，即得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤3种单一成分对照品储备液；精密称取腺苷、肌苷的对照品适量，分别置10 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度分别为170、210 μg·mL^-1的溶液，即得腺苷、肌苷2种单一成分对照品储备液。依次取上述5个成分的对照品储备液各1 mL，置同一个10 mL量瓶中，加水配制成上述5个成分质量浓度分别为17、22、25、17、21 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液

称取广地龙饮片粉末(过24目筛)1.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入生理盐水20 mL，称量，室温浸泡20 min，超声提取(250 W，40 kHz)40 min，放冷，用生理盐水补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

3 色谱条件

采用TDSOH公司TSK-GEL C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.1%甲酸水溶液-甲醇(99:1)为流动相，等度洗脱40 min，流速1.0 mL·min^-1，检测波长260 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

4 特征图谱 4.1 方法学考察 4.1.1 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液(31号样品)10 μL，按上述色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以次黄嘌呤峰(峰4)为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间的RSD < 1%，相对峰面积的RSD < 3%，相似度均在0.998以上，表明仪器精密度良好。

4.1.2 稳定性考察

精密吸取同一份供试品溶液(31号样品)10 μL，分别于0、1、2、4、6 h按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以次黄嘌呤峰(峰4)为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间的RSD < 1%，相对峰面积的RSD < 5%，相似度均在0.997以上，表明供试品溶液于6 h内测定结果稳定。

4.1.3 重复性试验

称取31号样品粉末1.0 g共6份，精密称定，按“2.2”项下方法分别制备供试品溶液；精密吸取供试品溶液10 μL，分别进样测定，记录色谱图。以次黄嘌呤峰(峰4)为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰相对保留时间的RSD < 1%，相对峰面积的RSD < 3%，相似度均在0.999以上，表明本方法重复性良好。

4.2 广地龙特征图谱的建立

取不同批次的广地龙及其伪品饮片粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，分别进样测定，记录40 min的HPLC色谱图(见图 1)。根据结果，将18批参环毛蚓、12批大腔蚓、11批暗孔远盲蚓的图谱分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)》，生成广地龙及2种伪品饮片的特征图谱(见图 2)。

4.3 特征图谱结果分析

根据18批不同来源广地龙饮片的特征图谱分析，主要有7个特征共有峰；经过与对照品比对，标定了4个特征峰，其中1号峰为尿嘧啶，4号峰为次黄嘌呤，6号峰为黄嘌呤，7号峰为肌苷，其他峰为未知成分峰。2种伪品均有8个特征共有峰；经过与对照品比对，共标定5个特征峰，其中1号峰为尿嘧啶，4号峰为次黄嘌呤，6号峰为黄嘌呤，7号峰为肌苷，8号为腺苷，其他峰为未知成分峰。18批广地龙正品饮片图谱与特征图谱的相似度分别为0.966、0.988、0.989、0.963、0.961、0.912、0.971、0.962、0.976、0.918、0.948、0.925、0.968、0.932、0.874、0.972、0.967、0.907，显示除15号样品图谱与特征图谱之间相似度为0.874外，其余各批次广地龙饮片相似度均大于0.90，表明相似度较好。

5 不同品种广地龙饮片中5个核苷类成分的含量测定 5.1 系统适用性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样检测，尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、肌苷与其相邻色谱峰的分离度均 > 1.0，理论塔板数以各色谱峰计均在1万以上。混合对照品及样品的色谱图见图 3。

5.2 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液0.2、1.0、2.0、5.0 mL，分别置于4个10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合对照品溶液。精密吸取各系列浓度混合对照品溶液及对照品储备液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度X(μg·mL^-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表 2，表明各成分在相应线性范围内线性关系良好。

5.3 检测下限与定量下限测定

取“2.1”项下混合对照品溶液，用水逐级稀释后进样测定，测得尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷的检测下限(S/N=3)分别为0.13、0.18、1.12、0.12和0.72 μg·mL^-1，定量下限(S/N=10)分别为0.44、0.58、3.71、0.40和2.38 μg·mL^-1。

5.4 精密度试验

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷峰面积的RSD(n=6)分别为0.10%、0.11%、0.67%、0.20%、0.42%，表明仪器精密度良好。

5.5 重复性考察

取31号样品粉末6份，分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量及RSD。结果各样品中的尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷的平均含量分别为201.35、260.86、1396.84、409.66、791.91 μg·g^-1，RSD分别为2.3%、0.99%、1.3%、1.0%、2.1%，表明重复性良好。

5.6 溶液稳定性试验

取同一份供试品溶液(31号样品)，分别于0、1、2、4、6 h进样测定。结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷峰面积的RSD(n=6)分别为1.3%、3.0%、3.1%、1.7%、3.0%，结果表明供试品溶液在6 h内稳定。

5.7 加样回收率试验

取已知含量的31号样品粉末6份，每份0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入5种单一成分对照品储备液(尿嘧啶100.68 μg·mL^-1、次黄嘌呤130.43 μg·mL^-1、黄嘌呤698.42 μg·mL^-1、腺苷204.83 μg·mL^-1、肌苷395.96 μg·mL^-1)1 mL，分别按照“2.2”项下方法制备供试溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷平均加样回收率(n=6)分别为103.3%、97.3%、96.7%、95.5%和107.0%，RSD分别为1.5%、1.9%、1.3%、2.0%、和2.3%。表明本方法的回收率良好。

5.8 样品含量测定

分别取不同批次的广地龙饮片粉末(过24目筛)，每批样品取2份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10 μL，按“3”项下色谱条件进行测定，用外标法计算出含量，结果见表 3。

6 讨论 6.1 提取方法的优选

为了获得较高的提取效率，对样品的提取方法进行了比较，同时优化了提取溶剂、提取时间等相关参数。供试品溶液制备方式考察了超声提取和回流提取^[14-16]，对比回流提取法，超声提取不仅效率高，而且对待测物的干扰程度小；为选择最佳提取溶剂，对5%甲醇、10%甲醇、水、生理盐水的提取效率进行了考察，最终选定生理盐水作为提取溶剂；取1.0 g样品粉末共3份，用20 mL生理盐水浸泡20 min后，分别超声提取30、40、50 min，结果表明，40 min提取核苷类成分效果最优。故本实验选用生理盐水浸泡20 min，然后超声提取40 min作为制备供试品溶液的方法。

6.2 色谱条件优化

为比较流动相对峰形的影响，考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水3种流动相，其中采用甲醇-水的结果优于乙腈-水，加入甲酸可以改善峰形，故采用甲醇-0.1%甲酸水作为流动相。本实验在流动相为甲醇-0.1%甲酸条件下选用Agilent TC-C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Thermo TSK-GEL C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)分析柱进行条件优化，结果表明，后者的分离效果和成分的峰形更好，最终确定了本文所述色谱条件。此外，利用二极管阵列检测器(DAD)对混合对照品溶液进行全波长扫描，在260 nm波长下各检测成分在本文色谱条件下有最优吸收，峰形较好，基线平稳，故最终选取260 nm作为检测波长。

6.3 特征图谱的比较

在收集到的41批广地龙饮片中，经鉴定有18批饮片来源为正品参环毛蚓，另有12批饮片来源为大腔蚓，11批饮片来源为暗孔远盲蚓。从3种饮片的特征图谱中可以看出，参环毛蚓与2种伪品差异明显，参环毛蚓特征图谱中未检测到腺苷，而2种伪品的特征图谱中均含有腺苷，表明腺苷是区分参环毛蚓和及其常见伪品(大腔蚓和暗孔远盲蚓)的特征成分。

6.4 含量测定结果比较

由表 3可见，12批大腔蚓和11批暗孔远盲蚓中均含有尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷，18批正品广地龙(参环毛蚓)中未检测到腺苷。正品广地龙饮片中肌苷的含量范围为1.413~23.382 mg·g^-1，平均值为(9.03±7.76)mg·g^-1，明显高于2种伪品[含量范围为0.985~4.654 mg·g^-1，平均值为(2.07±0.88)mg·g^-1]；正品中次黄嘌呤的含量范围为0.309~6.133 mg·g^-1，平均值为(2.75±1.71)mg·g^-1，明显高于2种伪品(含量范围为0.135~0.923 mg·g^-1，平均值为(0.52±0.22)mg·g^-1。3种地龙饮片中不同批次之间尿嘧啶和黄嘌呤的含量范围分别为0.021~0.408 mg·g^-1和0.395~4.714 mg·g^-1，平均值为(0.14±0.09)mg·g^-1和(1.65±0.82)mg·g^-1，不同品种之间差异不明显。

6.5 小结

本实验在同一色谱条件下，建立了广地龙饮片及其伪品的特征图谱，并同时测定不同批次饮片中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷和肌苷5个指标成分的含量，方法简便、快速、准确，具备了定性和定量双重作用，为有效控制广地龙饮片的质量提供了科学依据。