2019, Vol. 39 
2. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心, 南京 210023;
3. 雷允上药业集团有限公司, 苏州 215003;
4. 南京中医药大学附属南京中医院, 南京 210001
2. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210023, China;
3. Leiyunshang Pharmaceutical Co. Limited, Suzhou 215003, China;
4. The Affiliated Nanjing Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing, 210001, China
中药成分复杂多样，常采用多指标成分测定进行质量控制，但因所需对照品数量众多，费用较高，限制了其应用[1-2]。一测多评(quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)是以样品中1个典型成分(有对照品供应者)为内参物，建立该成分与其他成分的相对校正因子(RCF)，通过RCF计算其他成分含量的方法[3-7]，测定多种成分的同时克服了对照品紧缺和检测成本高的困难。
六神丸由蟾酥、麝香等药物组成，具有清热解毒、消肿止痛之效，可用于治疗扁桃体炎、口舌糜烂、咽喉肿痛、牙周炎及痈疽疮疖等[8]，其中蟾酥的主要活性成分为蟾蜍二烯内酯类成分[9-13]。本文以华蟾酥毒基为内参物，建立其与远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基的相对校正因子，实现一测多评，为六神丸的质量控制提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters 2695型高效液相色谱仪，PDA 2998检测器(Waters公司)；Agilent 1200型高校液相色谱仪，G1315D DAD检测器(Agilent公司)；Waters Xbridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；汉邦Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；FA1204B型分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，XP6型微量分析天平(Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CL21 R型高速离心机(Thermo Fisher公司)；Milli-Q型超纯水系统(Millpore公司)。
1.2 试药对照品蟾毒灵(批号111981-201501，纯度99.2%)、脂蟾毒配基(批号110718-201809，纯度98.0%)和华蟾酥毒基(批号110803-201408，纯度99.6%)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；对照品远华蟾毒精(批号JBZ-1547，纯度≥98%)、蟾毒它灵(批号JBZ-0195，纯度≥98%)和华蟾毒它灵(批号JBZ-0525，纯度≥98%)均购自南京金益柏生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。六神丸(雷允上药业有限公司，规格：每1 000粒重3.125 g，批号QA18017C、QA18002B、QA18005B、QA18006A、QA18008B、QA18010A、QA18016B、QA18017A、QA18019A、QA18022A、QA18022B、QA18023B、PA18015B、PA18022B、PA18029B)。
2 方法与结果 2.1 混合溶液制备 2.1.1 对照品溶液分别取远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为0.947 9、0.889 7、1.460 4、0.978 9、1.531 0、1.505 0 mg·mL-1的单一对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度为远华蟾毒精94.79 μg·mL-1、蟾毒它灵88.97 μg·mL-1、华蟾毒它灵146.04 μg·mL-1、蟾毒灵97.89 μg·mL-1、脂蟾毒配基153.10 μg·mL-1和华蟾酥毒基150.50 μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液取本品粉末(过5号筛)约0.2 g，精密称定，精密加甲醇10 mL，密塞，称量，超声(工作频率40 kHz，功率250 W)处理1 h，用甲醇补足失去的量，摇匀，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液即得。
2.1.3 阴性对照溶液按照六神丸配方比例制备方法，制备缺蟾酥的阴性样品，按照“2.1.2”项下方法操作，制备缺蟾酥的阴性对照溶液。
2.2 液相色谱条件Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters Empower工作站。色谱柱：Waters Xbridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱程序见表 1；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：296 nm；进样量：10 μL。
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表 1 梯度洗脱程序 Tab.1 Gradient elution procedures |
按上述色谱条件，分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定，结果见图 1。各待测物色谱峰与其他干扰峰分离度良好，阴性对照溶液的色谱中，在与远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基相对应的保留时间处无干扰峰。
2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液适量，分别稀释2、4、8、16、32、64倍，进样10 μL进行测定，以对照品的进样量(X)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。取混合对照品溶液逐级稀释，以信噪比为10考察各成分的定量下限。结果见表 2。在一定范围内，各成分进样量与峰面积有良好的线性关系。
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表 2 6个成分线性范围、回归方程和相关系数 Tab.2 Linearity ranges, regression equations and correlation coefficients of 6 components |
取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次测定，记录峰面积，计算远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基峰面积的RSD分别为0.45%、0.63%、0.38%、0.41%、0.34%、0.34%，表明仪器的精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取六神丸(批号PA18015B)粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24、48 h进样测定，计算远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基峰面积的RSD分别为2.6%、2.7%、2.6%、2.7%、2.6%、2.9%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取六神丸(批号PA18015B)粉末6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积，计算六神丸中6个成分的含量，远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基的平均含量分别为1.15、1.14、1.82、1.1、0.94、2.26 mg·g-1，RSD分别为2.7%、1.8%、1.6%、2.1%、1.8%、2.6%，表明该法重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取上述6个对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含华蟾毒精224.34 μg、蟾毒它灵225.54 μg、华蟾毒它灵397.55 μg、蟾毒灵206.56 μg、脂蟾毒配基199.34 μg、华蟾酥毒基443.35 μg的混合对照品溶液；另取已测定含量的六神丸(批号PA18015B)粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，分别加入上述混合对照品溶液500 μL，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积数据，计算远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的平均回收率(n=6)分别为102.3%、97.9%、108.2%、99.8%、104.0%、96.2%，RSD分别为2.4%、2.3%、2.9%、2.3%、1.6%、2.0%，符合回收率要求，表明测定方法准确可靠。
3 RCF和相对保留时间的测定 3.1 RCF的计算精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液1 mL，分别稀释2、4、8、16、32、64倍，按“2.2”项下色谱条件进样分析，以华蟾酥毒基为内参物，计算待测成分远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和脂蟾毒配基的RCF，得上述4个成分的RCF分别为0.897、0.965、1.023、0.844、0.964，RSD分别为0.46%、1.1%、0.83%、0.66%、0.39%，符合要求。RCF的计算公式为[14]
| $ {f_{{\rm{s/i}}}} = \frac{{{f_{\rm{s}}}}}{{{f_{\rm{i}}}}} = \frac{{{C_{\rm{i}}} \times {A_{\rm{s}}}}}{{{C_{\rm{s}}} \times {A_{\rm{i}}}}} $ |
式中As为内参物峰面积，Cs为内参物的浓度，Ai为待测组成分i的峰面积，Ci为待测组分i的浓度。根据所测定的RCF，计算待测组分i的浓度，计算公式为
| $ {C_{\rm{i}}} = {f_{{\rm{s/i}}}} \times \frac{{{C_{\rm{s}}} \times {A_{\rm{i}}}}}{{{A_{\rm{s}}}}} $ |
式中Ci为待测组分i的浓度，fs/i为待测组分i的RCF，Cs为内参物的浓度，As为内参物的峰面积，Ai为待测组分i的峰面积。
3.2 RCF的重现性取混合对照品溶液，按“2.2”项下液相色谱条件，分别考察Waters 2695、Agilent 1200高效液相色谱仪和Waters Xbridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、汉邦Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱对RCF的影响，结果见表 3。由表可知，不同高效液相色谱仪和不同品牌的色谱柱对RCF无显著影响。
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表 3 不同高效液相色谱仪及色谱柱测定的RCF Tab.3 RCFs determined by different HPLC instruments and columns |
相对保留时间是QAMS法中待测色谱峰的定位方法之一。本次实验考察了在不同高效液相色谱仪和不同品牌色谱柱中待测组分的相对保留时间的重现性，结果如表 4所示。不同型号品牌的高效液相色谱仪和色谱柱对所测6个成分的相对保留时间值的影响较小(RSD＜5.0%)。
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表 4 不同高效液相色谱仪及色谱柱测定的相对保留时间值 Tab.4 Relative retention time determined by different HPLC instruments and columns |
取15批不同批号的六神丸粉末，按照“2.1.2”项所述方法制备供试品溶液；分别吸取供试品溶液10 μL，按“2.2”项下色谱条件进样，记录峰面积。采用ESM和QAMS法计算六神丸粉末中远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和脂蟾毒配基的含量，结果见表 5。结果表明2个含量测定方法没有显著差异，相对误差(relative error，RE)的绝对值[RE=(QAMS计算值-ESM实测值)/ESM实测值×100%]均小于3%，在可接受范围内。
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表 5 QAMS法与ESM测得六神丸中蟾酥6个成分的含量(mg·g-1，n=2) Tab.5 Determination of 6 active components in Liushen pills by QAMS method and ESM |
《中华人民共和国药典》2015年版规定蟾酥质量标准的指标性成分为脂蟾毒配基和华蟾酥毒基[9]，两者在蟾酥中含量较高，活性较强，且对照品在市场流通性较高，易于获得，因此首先将两者作为内参物的选择。此外，在对RCF的重现性考察过程中发现，两者因结构相似，因此保留时间也较为相近，但是会因不同品牌色谱柱的填料和性能差异而导致出峰顺序不同。考察中发现：Waters品牌的色谱柱，脂蟾毒配基先出峰；而其他品牌的色谱柱，如Agilent和Kromasil填料的色谱柱，华蟾酥毒基先出峰。实验中发现，以华蟾酥毒基的保留时间为参考，更有利于其他5个峰的准确定位，因此最终选择华蟾酥毒基为内参物。
4.2 色谱峰的准确区分本法通过相对保留时间来准确定位所需色谱峰，但在2号峰蟾毒它灵和3号峰华蟾毒它灵附近有保留时间相近的杂质峰。对比紫外吸收光谱发现，2号峰的最大吸收波长为297.1 nm，3号峰的最大吸收波长为295.9 nm，符合蟾蜍二烯内酯类成分的吸收特点，而2个杂质峰的紫外光谱图在此波长处未见明显的吸收峰，可以此区分。
4.3 供试品溶液制备方法、流动相和柱温的考察本实验直接应用前期供试品溶液制备方法考察结果。为了降低检测成本，实现一测多评，本研究在实验室前期对于蟾酥多种活性成分同时测定[15]的基础上，对方法进行了改良，考察了不同流动相的分离效果，发现乙腈-0.2%磷酸水溶液洗脱分离效果好，并比较了不同柱温条件对分离效果的影响，结果发现当柱温为30 ℃时，分离效果较好。
4.4 小结采用QAMS测定六神丸中6个蟾蜍二烯内酯类成分的含量与常用的ESM测得的含量没有显著差异，表明通过QAMS实现对六神丸中蟾酥有效成分的含量测定准确可行。
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