相比于口服给药，口腔黏膜给药途径由于具有避免肝脏首过效应，提高药物生物利用度；避免药物在胃肠道的降解；顺应性好和发生不良反应能及时停药等优势而越来越受到关注。而药物经口腔黏膜吸收与口服制剂截然不同，其属于胃肠道外给药途径，需制定专属的质量评价方法。因此，本文从理化性质、黏附时间、黏附强度、黏膜渗透性、体外释放、体内药动学方面着重阐述口腔黏膜制剂质量评价相关方法和设备，为今后口腔黏膜制剂评价提供指导。

1 口腔黏膜制剂现状

从表 1可以看出，2000-2018年FDA批准的创新型（NDA）口腔黏膜制剂呈递增趋势：2000-2004年，仅有2个；2005-2009年，有4个；而2010-2014年，高达7个；2015-2018年，有4个；且所批准的制剂类型主要为口腔片剂和口腔膜剂。但在所有FDA批准的制剂中，批准的口腔黏膜制剂数量远远低于其他给药途径，这与人体口腔黏膜生理结构较为独特，目前缺乏标准的口腔黏膜制剂质量评价指导，研究数据缺乏理论意义有关。

英国2000年以后批准的口腔黏膜化药制剂共有12个，9个为舌下黏膜给药，仅3个为颊粘膜给药，且除三硝酸甘油酯为喷雾剂外，其余都是片剂。与国外相比，我国目前上市的口腔黏膜制剂较为单一，仅有8种，分别是盐酸丁丙诺啡舌下片、尼古丁舌下片、盐酸阿扑吗啡舌下片、盐酸纳洛酮舌下片、盐酸二氢埃托啡舌下片、甲硝唑颊片、硝酸甘油气雾剂和舌下片，在药物经口腔黏膜吸收机制的基础上建立质量评价体系，将推动口腔黏膜给药系统朝多剂型、多药物的方向发展。

2 人体口腔黏膜生理特点

人体口腔颊黏膜的厚度为500~800 μm，舌下和齿龈黏膜在100~200 μm之间，颊粘膜与舌下黏膜为非角质化黏膜，而硬腭与牙龈黏膜为角质化黏膜。药物经不同类型口腔黏膜渗透性由高到低依次为舌下黏膜＞颊黏膜 > 硬腭、牙龈黏膜。对于角质化黏膜给药方式，主要产生局部作用；舌下黏膜由于血管化程度高，膜渗透性好，主要发挥全身作用且起效迅速，但由于舌下唾液分泌量较大以及舌头的影响，药物不能长时间的黏附于舌下黏膜；而颊黏膜则相对静止，适合于缓控释制剂发挥全身和局部的双重作用^[1]。口腔和颊黏膜的组织示意图如图 1所示。药物透过黏膜组织吸收后，经颈静脉、上腔静脉直接进入体循环。

同时，口腔中的唾液和黏液蛋白会对药物的吸收、释放产生一定的影响。唾液是由腮腺、下颌下腺和舌下腺分泌的一种中等黏性的水状液体，由黏液、蛋白质、矿物质、酶等组成，pH在5.5~7之间，平均渗透压为50~60 mosmol·kg^-1[2]，其分布于口腔表面，厚度在70~100 μm之间。平静时唾液流量在0.5 mL·min^-1左右，咀嚼时流量高达7 mL·min^-1，每日分泌0.5~2 L，但由于持续吞咽，唾液在口中的体积约为1 mL。唾液中的黏蛋白相对分子质量在5×10⁵~2×10⁷，在生理情况下带有负电荷，使其能够在口腔上皮细胞上形成凝胶层^[1]。口腔独特的生理环境需要根据人体口腔生理状况，制定合适的、标准的口腔黏膜制剂质量评价方法，而不是参照口服制剂。

3 质量评价

口腔黏膜制剂的质量评价主要包括理化性状、黏附时间、黏附强度、黏膜渗透性、体外释放、体内药动学，对于不同制剂，除理化性状检查项各不相同外，其余检查项评价方法大致相同，并与药代、药效密切相关，更应制定符合人体口腔黏膜生理状况的评价体系。

3.1 理化性状

口腔黏膜给药制剂的剂型包括片剂（含贴片、含片、舌下片、黏附片，速溶片等）、膜剂、凝胶、喷雾剂、含漱液、口腔溶液、胶浆及泡沫剂等，从表 1可以看出片剂与膜剂是最主要剂型，因此，在理化性质方面，本文主要总结片剂与膜剂的质量评价方法，表 2、3对这2种剂型物理性质质量评价进行比较。

对于膜剂，厚度测定是测定同一膜剂不同部位的厚度差异，而片剂是测定不同片剂的厚度差异，理想口腔黏膜膜剂厚度在50~100 μm。

膜剂的抗张强度（TS）是通过TA.XT2质构仪测定的，将膜剂置于带有橡胶垫或棉垫的2个夹子中，以防止切断膜剂和便于固定。2个夹子的距离小于膜剂的长度，上夹以20~120 mm·min^-1的速度上移直至膜断裂。其TS（MPa）通过公式（1）来计算^[3]：

$ {\rm{TS = }}{\mathit{F}_{{\rm{max}}}}/\mathit{A }{\rm{, }}\;\mathit{A = t} \times \mathit{s} $

(1)

式中，F_max为断裂时的最大力（N），A为膜剂的初始横截面积（mm²），t为膜剂厚度，s为膜剂宽度。

断裂伸长率（E/B，%）通过公式（2）计算获得^[3]：

$ {\rm{E/B}} = \frac{{L - {L_0}}}{{{L_0}}} \times 100\% $

(2)

式中，L₀为膜剂初始长度；L为断裂时膜剂的长度。

Young′s系数又称弹性系数，是指弹性变形区域应力与应变的比值，用于描述膜剂的硬度。硬、脆的膜剂具有高TS，低E/B（%），高的Young′s系数；具有低Young′s系数的膜剂易发生形变。Young′s系数通过公式（3）计算而得^[4-5]：

$ {\rm{Young's}}系数 = \left( {应力 - 应变斜率/膜的横截面面积} \right) \times 100\% $

(3)

而片剂的TS则不需要仪器测定，可通过传统的破碎力测试获得片剂的最大破碎力F（N），然后利用公式（4）计算获得^[6]，但该公式只适用于圆形片剂：

$ {\rm{TS}} = 2F/{\rm{ \mathsf{ π} }}dT $

(4)

式中，F为片剂的最大破碎力（N），d为片的直径（mm），T为片的厚度（mm）。

溶胀性试验所采用的介质可以是pH 6.4~7.4的磷酸盐缓冲液、人工唾液、0.9%氯化钠溶液，每个制剂只能测定1个时间点，至少检测6个时间点。有研究者每隔5 min在制剂上加0.1 mL介质^[7]，或将制剂放置于海绵上^[8]模拟制剂在不断分泌的少量唾液中慢慢溶胀的过程。溶胀后的膜剂易破损，可以待膜剂溶胀后用吸管吸去周围的液体，比较整个体系溶胀前后重量差异。

膜剂的表面pH是将膜剂置于4 mL左右介质中（pH 6.8磷酸盐缓冲液、人工唾液等）溶胀2 h后，用pH计测定膜剂表面pH。为减少误差，也可将琼脂溶于热介质中，待冷却凝固后，膜剂放于琼脂上检测^[7]。

3.2 黏附时间

黏附时间可通过体内、体外、离体组织3种方法测定。最便捷的测定方法就是直接将制剂黏附于容器内表面，搅拌介质，记录剥离或溶蚀时间。但该方法未用到动物黏膜，无法反映制剂在口腔中的实际情况，仅可作为初步筛选。可以将猪颊黏膜黏附于烧杯内表面，膜剂的黏附侧用50 μL的人工模拟唾液润湿后，轻压20 s使其黏附于猪颊膜上，加入37 ℃的人工模拟唾液800 mL，平衡2 min后，以150 r·min^-1的速度搅拌介质，观察膜剂剥离或溶蚀情况^[9]，也可以将黏膜用黏蛋白溶液润湿后黏附于载玻片上，再置于烧杯中^[8]。为符合生理状况，越来越多的研究者选用溶出装置进行检测^[10]，如Celik^[6]利用改良的崩解仪测定黏附时间以模拟颊黏膜制剂在口腔中的状态。去除原有装置中的篮子，黏膜垂直黏附于玻片上，制剂润湿后轻压30 s黏附于黏膜后，仪器下移使制剂浸于介质（pH 6.6磷酸盐缓冲液500 mL）的最低点，如图 2所示。对于纳米粒等聚合物可通过荧光成像评价其黏附时间，同时可获得制剂渗透性等信息，但由于所用动物通常为大鼠，其口腔黏膜结构与人体有较大的差异^[11]，也有将荧光成像与Flow-through流通池相结合测定水凝胶的黏附时间^[12]。体内黏附时间通常是将安慰剂润湿后轻压黏附于人体口腔中合适的位置，同时可以考察制剂有无刺激性、口干、苦味等缺陷^[3]。口腔黏膜给药制剂的黏附时间通常要求在4~10 h。

3.3 黏附强度

黏附强度是指将制剂与黏膜相分离的力。强的黏附强度并不表示具有长的黏附时间，因为前者与聚合物链的结构、电荷密度有关，而后者是基于聚合物的溶解或溶蚀。直接测定法主要使用质构仪，该装置如图 3所示。Wong等^[14]将动物组织固定于下支架上，片剂使用双面胶黏附于上支架上。测试时，先用200 μL的模拟唾液均匀涂布在组织表面，上支架以0.5 mm·s^-1的速度下移，在给予一定的黏附力使两者接触一定时间后，上支架以0.5 mm·s^-1的速度离开，直至到20 mm处。研究表明在使用该装置测定黏附强度时，接触时间越长，探针速度越快，实验的重现性与灵敏度越高，且在一定范围内，黏附力也会对制剂黏附性产生影响。改良的双臂天平也被广泛用于测定黏附强度，如Ansari等^[15]采用图 4装置进行测定。盖玻片在涂布10 μL黏蛋白溶液后，将其背面黏附于左侧臂的上下表面，膜剂置于下表面的盖玻片上。通过移去右托盘中5 mg的砝码，使上表面的盖玻片与下表面盖玻片中的膜剂相接触。3 min后在右托盘慢慢增加量直至两者分开，需要注意的是此方法黏度强度为膜剂分离时的总量减去5 mg预加量。但该实验未用黏膜材料，只能是初步评估，不可作为最终制剂评价，且砝码无法精确测定黏附强度。Raafat等^[16]通过内部轮滑系统用水代替砝码对其进行改造，如图 5所示。左右两侧均有小塑料杯，塑料杯底部黏附预先浸在人工唾液中的黏膜制剂，塑料杯垂直下方为上下可移动支架，黏膜材料黏附在支架上。该膜剂与黏膜材料的位置与Ansari^[17]所采用的相反，这更符合是将制剂黏附于黏膜的实际情况。通过在左侧小塑料杯施加预重100 g使两者接触，2 min后去除，再通过在右侧塑料杯中逐渐加水直至分离。此时，右侧塑料杯中水的量即为黏附强度。

Hoffmann等^[2]基于唾液具有阻碍制剂黏附的生理特点制备如图 6所示的黏附性检测装置。猪颊膜固定于金属片后置于黏膜黏附池顶部，37 ℃水浴平衡15 min后，用2滴唾液润湿黏膜，片剂置于黏膜上。人工唾液以0.5 mL·min^-1的速度冲洗60 min后，测定黏附在黏膜上和黏附池唾液中的药物量，该方法在测定生物黏附性时具有较好的重现性。也可采用比色法考察黏蛋白对聚合物的吸附，黏蛋白溶于磷酸盐缓冲液中制成2 mg·mL^-1的黏蛋白溶液，药物与黏蛋白溶液于100 r·min^-1（37 ℃）搅拌混合1 h后离心。上层游离的黏蛋白可通过高碘酸/西弗（PAS）比色法测定，这适用于研究初期的通量筛选^[11]。

3.4 黏膜材料的选择

目前，黏膜材料通常选用动物黏膜，但动物黏膜与人体口腔黏膜之间必然存在差异。Sa等^[17]比较犬、大鼠、豚鼠、兔、猪、牛、羊7种动物的硬腭、颊黏膜和人体口腔的相似度。结果表明，所有动物的硬腭都是角质化的，而颊黏膜存在着明显的种族差异：人、狗、猪的颊黏膜是未角质化的；鼠、豚鼠、羊、牛的颊黏膜是角质化的；兔子是半角质化的。通过形态学（基底膜外观、上皮细胞厚度、嵴的长度、相邻嵴之间的距离、硬腭与颊黏膜嵴之间距离的差异）与免疫组织学（Ki67与CK19表达）分析，表明狗的口腔黏膜与人最为相似，其次为猪黏膜。由于猪黏膜在可获得性、价格、伦理性方面优于犬，目前最广泛使用的、认可度较高的动物黏膜为猪黏膜。

动物口腔上皮黏膜需从刚处死（1~2 h内）的动物口腔中，通过手术、加热、化学等方法获得，手术方法可利用植皮刀得到厚度均一的黏膜（0.8 mm±0.1 mm）^[18]，加热方法是通过将组织浸于60 ℃缓冲液（生理盐水、Krebs等）1 min后，将结缔组织小心地从黏膜上剥离出，得到带有完整基底膜的上皮组织^[7]，化学方法易降低黏膜活性。使用动物黏膜时，实验最好在动物死亡后9 h内完成，防止黏膜失去活性。为避免动物黏膜在分离过程中破损、在实验过程中失活，人工黏膜与颊细胞培养逐渐受到关注。

Mura等^[19]基于最小的脂相浸渍量差异，实验重复率高，萘普生表观渗透系数（P_app）接近于理想值选取醋酸纤维素-硝酸复合膜为脂相载体。黏膜渗透实验前，将其浸于含胆固醇-磷脂的正辛醇脂相溶液中60 min，结果发现其P_app与猪颊黏膜十分接近[（1.543±0.045×10⁻⁵）cm·s⁻¹ vs.（1.560±0.049×10⁻⁵ cm·s⁻¹）]。但该实验还需不同亲脂性药物来验证该膜与人体黏膜的相关性。Cook等^[20]发现含有20% N-丙烯酰葡萄糖氨（AGA）和80%的聚甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）的水凝胶在测试片剂和液体制剂的黏膜黏附性时能有效模拟猪颊黏膜，Da Silva等^[12]进一步验证该人工黏膜在用质构仪测定温敏性半固体制剂的黏膜黏附力和用Flow-through流通池测定温敏型半固体制剂的黏附时间中能够很好地模拟颊黏膜。使用大豆卵磷脂S100薄膜对美托洛尔进行黏膜渗透性评价时，发现该结果与微型猪的药物代谢动力学具有很好的体内体外相关性，显示该膜具有检测pH依赖渗透型药物的潜力^[21]。但用人工膜进行黏膜黏附性和渗透性研究只适用于研究的初期阶段，其最终还是需用动物黏膜。

Yang等^[22]比较药物经Epioral^®（由正常人口腔上皮细胞衍生而来）、LLC-PK1（猪肾细胞培养得到）、Caco-2（人克隆结肠腺癌细胞）3种细胞的渗透性与经猪颊黏膜、猪舌下黏膜的相关性。研究发现，Epioral^®的渗透系数与猪口腔黏膜具有很高的相关性（颊黏膜：r²=0.87；舌下黏膜：r²=0.88），然而，对于低渗透性药物，Epioral^®渗透值可能高达猪颊黏膜11倍，如氯沙坦（0.69×10^-6 cm·s^-1 vs. 0.064×10^-6 cm·s^-1），但其渗透值与猪舌下黏膜较为接近，如氯沙坦（0.69×10^-6 cm·s^-1 vs. 0.29×10^-6 cm·s^-1）。该差异可能是由黏膜结构与厚度差异引起，人体舌下和颊黏膜分别含10和50亚层，而Epioral^®仅含有8~12亚层。LLC-PK1相比于Caco-2更接近于猪口腔黏膜（猪舌下黏膜：r²=0.75；猪颊黏膜：r²=0.81）。除此之外，取自人类鳞状颊细胞癌的TR146细胞系也常用作黏膜材料，但由于发生癌变，其渗透屏障功能不如猪颊黏膜。Marxen等^[23]在研究黏蛋白对渗透性影响时，对于所有的培养介质和药物，TR146的渗透系数均高于猪颊黏膜，如尼古丁以生理盐水为培养介质，其P_app分别为8.3±1.5、5.4±0.43，该差异可通过研究其相关性进行折算减小。这3种黏膜材料的优缺点如表 4所示，应根据实验目的合理选择黏膜材料。

3.5 黏膜渗透性

目前，黏膜渗透性评价大多选用离体动物组织，测定仪器主要是Franz扩散池、Flow-through流通池、尤斯灌流室3种，其中Franz扩散池由于装置简单，应用较为广泛。Franz扩散池如图 7所示，其上半部分为供体室，下半部分为接收室，接收室中含有磁力搅拌器，以300 r·min^-1左右速度不断搅拌接收室中的介质。接收室与供体室之间放置动物黏膜（有效面积在0.64 cm²左右），黏膜上皮朝向供体室，整个装置利用水夹套维持在37 ℃。渗透介质通常为pH 6.4~7.4的磷酸盐缓冲液、pH 7.4 Krebs缓冲液。实验开始时，供、受体室注入5~25 mL的介质，离体组织平衡0.5~1 h后，移去供体室介质，将药物放于离体组织上，并在其上滴0.5 mL左右的人工唾液，以模拟口腔环境。然后在规定时间从接收室取样、补液^[13]。由于接收室容积小，对于难溶性药物难以维持漏槽条件，需要加入增溶剂如乙醇等，但这可能会影响离体组织的活性^[24]。对此，可使接收室中的液体处于流动的状态维持漏槽条件，该装置即Flow-through流通池。

Flow-through流通池如图 8所示，利用蠕动泵使接收室中的液体处于不断流动的状态，其流速虽不影响药物的渗透量，但会延迟达到平衡渗透值的时间^[26]。Lestari等^[27]对该装置进行改进，如图 9所示，通过垂直放置颊黏膜减少气泡的滞留，同时供体室药物溶液也不断更新，避免因药物浓度的下降而难以达到稳态渗透。考虑到含药溶液从供体室到达动物黏膜有时间差，在黏膜装置的供体侧装有玻璃室，其中装有5 mL药物溶液，保证在实验开始时就有药物溶液通过黏膜。在平衡离体组织以及实验过程中，该装置具有直接观察组织完整性的优势。平衡离体组织时，接收室中介质不断流动，而供体室部分没有溶液，若组织破损，则介质流入玻璃室中而不从接收室出口流出；若实验过程中在组织破损，则接收室出口也无液体流出。确认组织完整性后，玻璃室中装入药物溶液，供、受体室介质均以1.2 mL·h^-1速度灌注（从下往上），但该装置只针对于药物溶液。尤斯灌流室也是垂直放置动物黏膜，主要用于检测药物溶液，供、受体室容积为5 mL并通混合氧气（95%O₂、5%CO₂）以增加混合均匀性，有效扩散面积在1.77 cm²左右^[28]。

采用离体组织进行黏膜渗透实验，组织厚度、黏膜的完整性、黏膜活性等都会对药物渗透产生影响且实验过程复杂。体内渗透性实验，也称颊吸收试验，相比而言简单直观。为避免受试者无意识吞咽药物，通常在药物溶液中通常加入标记物。如受试者口含20 mL含药物和酚红的PBS溶液（pH 6.6），在规定时间取样，于最后的取样点收集所有剩余溶液，并用磷酸盐缓冲液20 mL润洗口腔，清洗物与最后取样液混合，检测药物与酚红含量^[24]。颊细胞灌注可用于研究影响药物渗透黏膜的因素，Marxen等^[23]选用TR146细胞研究黏蛋白对药物渗透的影响。从细胞顶端加入黏蛋白培养24 h后，顶端加供体室溶液，基底侧加接收室溶液，置于37 ℃、100 r·min^-1的恒温卧式振动筛中，于规定时间从基底侧取样，补液。细胞灌注还需考察跨膜电阻与甘露醇的渗透率以确保细胞的完整性，该实验显示黏蛋白与药物分子之间确实存在相互作用，但所引起的渗透差异可能是微不足道的。表 5对以上黏膜渗透性考察方法进行了比较。

3.6 体外药物释放

很多研究者采用桨法（USP Ⅱ溶出法）进行口腔黏膜制剂的体外释放，如图 10所示，制剂黏附于圆盘上，置于底部，释放介质可以是0.9%氯化钠溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、模拟唾液、水，介质体积在300~900 mL之间，转速在25~100 r·min^-1之间。桨法使用大体积的溶出介质，这与口腔中仅有少量唾液的生理状况不符。为此，可以将制剂置于小体积的玻璃瓶^[29]、表面皿、透析袋^[30]中，利用摇床振荡或磁力搅拌器搅拌，如Parodi等^[3]将膜剂置于玻璃管中的塑料网格上，130 r·min^-1磁力搅拌。也可以借助Franz扩散池^[9]与闭合式Flow-through流通池（USP Ⅳ溶出法）进行体外释放研究，且Flow-through装置包含多个流通池，可缩小机械性因素造成的差异，其还可通过与自动化取样装置和紫外检测装置直接相连而便于操作。采用Flow-through流通池进行体外释放时，须先将玻璃珠置于每个流通池顶部，再将制剂置于玻璃珠上，介质以5 mL·min^-1左右的流速，按层流形式流经每个流通池^[7，31-32]。除动物黏膜外，透析膜、半渗透膜、醋酸纤维素膜等人工膜被广泛用于黏膜制剂的体外释放实验，如Zhang等^[9]在用Franz扩散池进行体外释放研究时，选用事先在磷酸盐缓冲液（pH 6.8）浸泡过夜的0.22 μm醋酸纤维膜。虽然人工膜避免了离体组织分离的复杂过程，但目前没有足够的实验证实在体外释放中选用人工膜的合理性。

3.7 体内药动学

由于犬、猪的口腔黏膜在生理结构、酶活性等方面与人体较为相似，被广泛用于口腔黏膜制剂的体内药物代谢动力学研究^[28]，为减少成本，半角质化的兔口腔黏膜也常用作药物代谢动力学模型，在初期研究时可选择大鼠。取血时犬可从头静脉，猪可从颈静脉，兔和鼠可分别从耳缘静脉与复眼眶，全程动物需保持麻醉状态，以防吞咽。如对哥廷根小猪给予颊片后，使其平躺15 min，并用硬橡胶维持口腔张开以随时检查片剂的位置^[34]；Rachid等^[35]选用兔子进行舌下崩解片的药物代谢动力学实验时，借助扁平钳将片剂放于舌下，并给予水0.2 mL促进其崩解后将舌头轻轻放于片剂上，以防吞咽发生。人体药物代谢动力学可避免动物与人体间的差异，如Benvenga等^[36]比较人体中液体左旋甲状腺素不同给药方式的生物利用度差异。药物的口腔黏膜渗透性是影响药物生物利用度的重要因素，Yang等^[22]第1次揭示了体外渗透与人体口腔吸收之间的关系，发现猪舌下黏膜的渗透系数与人口腔吸收具有很强的相关性（r²=0.91）。

4 总结

准确的质量评价方法对口腔黏膜制剂的开发起着至关重要作用，口腔黏膜制剂在符合理化性质指标以及确保不会对黏膜产生刺激性的基础上，须考察与黏膜制剂吸收相关的黏附时间、黏附强度、黏膜渗透性等指标，建立类似于人的体外模型有助于获得体内-体外的高度相关性，使研究数据具有理论意义。对于研究初期的筛选工作，可寻找合理的动物黏膜替代品，如人工膜、颊细胞进行黏膜渗透性、体外释放等多项指标的考察，以减少成本，但最终制剂的质量评价仍须采用与人近似的动物黏膜，同时选用合适的动物或人可评价口腔黏膜制剂的刺激性和体内药动学，建立准确的评价方法有助于口腔黏膜制剂准确快速的开发和评价。