药品中污染微生物是影响药品质量安全的重要因素，严重威胁临床患者的用药安全。研究表明药品中污染的微生物可来源于药品生产过程中的多个环节^[1]。《中华人民共和国药典》2020年版编制纲要突出强调了药品生产全过程中微生物控制的重要性，且随着药品“全生命周期”质量控制理念的推广，制药企业中微生物的质量控制正从终产品控制逐渐向过程控制转变，环境监测是药品生产过程控制的重要环节，洁净生产环境是药品安全生产的基础保证，由于产品最终灭菌很难达到完全杀灭微生物的目的，所以药品生产环境的微生物污染程度直接关系着最终产品的质量，存在微生物污染的药品生产环境尤其是存在耐药微生物的环境更难保证始终如一地生产出合格安全的药品^[2]，因此实现药品生产环境污染微生物的有效控制对药品质量安全至关重要。

葡萄球菌中，凝固酶阳性葡萄球菌多为致病菌，受到普遍关注，如金黄色葡萄球菌是目前药品微生物检验中的重要控制菌，而凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）则被忽视。然而近年发现CoNS是药品生产环境的主要污染微生物，占到了50%以上^[3-4]，如上海地区无菌药品生产企业核心生产环境的微生物污染情况研究表明CoNS占全部污染微生物的52.7%，其中以表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌等人源性CoNS为主。此外，非无菌药品中常见的污染菌也主要为溶血葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌等CoNS。更重要的是，由于临床侵入性诊疗操作的增多，CoNS也成为临床感染的重要致病菌，易导致严重的CoNS感染，而且耐药率越来越高，给临床上的治疗带来了严峻的考验^[5-7]。2017年中国细菌耐药性监测显示CoNS中甲氧西林耐药株（MRCNS）的检出率为80.3%^[8]。

药品生产环境中耐药菌株的存在会给药品安全带来更高风险，对患者尤其是免疫力低下人群产生巨大威胁。目前有关临床感染葡萄球菌及食源性金黄色葡萄球菌耐药性研究较多^[9-11]，而对环境CoNS耐药性研究较少，尤其是药品及其生产环境中污染CoNS的耐药现状研究几乎是空白的，因此亟需对其开展耐药性研究。本文从制药企业生产环境中收集85株CoNS，并对其进行耐药谱研究，为制药企业加强药品环境监控，提高药品安全性和为监管机构提供有效的微生物风险评估，加强药品微生物监管提供数据支持与参考依据。

胰酪胨大豆琼脂平板（TSA，Biomerieux公司）；MIR-254型培养箱（SANYO公司）；移液枪（Eppendorf公司）；革兰需氧阳性菌药敏检测板（上海星佰生物技术有限公司）；VITEK 2 Compact全自动微生物生化鉴定系统（Biomerieux公司）；LABGARD型生物安全柜（Nuaire公司）；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒和Premix Ex Taq^TM DNA聚合酶试剂盒（TAKARA，大连宝生物工程有限公司）。

从药品企业生产环境中收集85株葡萄球菌，分离纯化后，参照《中华人民共和国药典》2015年版通则9204微生物鉴定指导原则，分别采用VITEK生化鉴定系统、16S rRNA特征序列比对方法、血浆凝固酶试验等进行菌种鉴定，具体鉴定结果为科氏葡萄球菌33株，表皮葡萄球菌27株，人葡萄球菌9株，溶血葡萄球菌6株，头状葡萄球菌5株，尼泊尔葡萄球菌5株。

使用革兰需氧阳性菌药敏检测板测定85株CoNS的最低抑菌浓度（MIC）。每块药敏板上，对每种抗生素都设有一系列对倍稀释浓度的抗生素试剂。具体操作：挑取新鲜培养的菌落数个，置2~3 mL灭菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管进行比浊，调整菌悬液为0.48~0.56麦氏单位浓度；取12 mL营养肉汤培养液倒入加样槽，吸取药敏培养液100 ^µL加入阴性对照孔；取菌悬液60 ^µL，加入药敏培养液中混匀进行稀释；用8通道或12通道微量移液器，吸取稀释液100 ^µL，加入96孔微量药敏板条；将板条放入恒温培养箱中35 ℃培养18~20 h。药敏板设有的15种抗生素名称及种类见表 1。

表 1 Tab.1

表 1 15种抗生素的名称及分类 Tab.1 Names and classifications of 15 antibiotics 抗生素大类 （antibiotic classes） 抗生素名称 （antibiotic name） 英文缩写 （abbreviation） β-内酰胺类（β-lactams） 青霉素（penicillin） PEN 苯唑西林（oxacillin） OXC 头孢西丁（cefoxitin） CFX 氨基糖苷类（aminoglycosides） 庆大霉素（gentamicin） GEN 四环素类（tetracyclines） 四环素（tetracycline） TET 大环内脂类（macrolides） 红霉素（erythromycin） ERY 喹诺酮类（quinolones） 左氧氟沙星（levofloxacin） LEV 多肽类（glycopeptides） 万古霉素（vancomycin） VAN 替考拉宁（teicoplanin） TEC 磺胺类（sulfonamides） 复方新诺明（sulfameth-oxazole） SXT 环脂肽类（cyclo-lipopeptide） 达托霉素（daptomycin） DAP 恶唑烷酮类（oxazolidinone） 利奈唑胺（linezolid） LZD 林可霉素类（lincosamides） 克林霉素（clindamycin） CLI 利福霉素类（rifamycins） 利福平（rifampicin） RIF 硝基呋喃类（nitrofurans） 呋喃妥因（nitrofurantoin） NIT

表 1 15种抗生素的名称及分类 Tab.1 Names and classifications of 15 antibiotics

自培养箱中取出药敏检测板，用微生物鉴定药敏分析系统或肉眼判读的方法对药敏板条进行读数，混浊为阳性，清晰为阴性，输入软件分析结果，经数据分析得到MIC值，并根据美国临床实验室标准化委员会CLSI（M100-S27）的相应标准获得相应敏感（S）、中度敏感（Ⅰ）和耐药（R）的结果。

85株CoNS对15种抗生素的耐药率、中介率、敏感率如图 1所示。结果表明，85株CoNS中只有4株对15种抗生素全部敏感，其余81株对15种抗生素具有不同程度的耐药性，其中对青霉素的耐药率最高（94.1%），其次为红霉素（80.0%）、头孢西丁（80.0%）、苯唑西林（63.5%）。四环素、替考拉宁、复方新诺明、克林霉素耐药率分别为21.2%、18.8%、17.6%和11.8%。需要注意的是替考拉宁中介敏感菌株18株（21.2%），提示着菌株存在较大的耐药水平升高风险。本研究未检出耐万古霉素、达托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因菌株。

图 1 85株CoNS分离株对15种抗生素的药敏统计图 Fig.1 Resistant rate of 85 CoNS isolates to 15 antibiotics

进一步比较分析生产环境主要污染微生物科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的耐药性（表 2）。结果发现，科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌对青霉素、红霉素、苯唑西林、头孢西丁、四环素、复方新诺明、克林霉素等均具有抗性；表皮葡萄球菌中替考拉宁耐药率为40.7%，左氧氟沙星耐药率为14.8%，庆大霉素耐药率为3.70%，而科氏葡萄球菌中未发现这3种抗生素的耐药菌株；2种葡萄球菌均对万古霉素、利福平、达托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因100%敏感。本研究结果表明表皮葡萄球菌总体耐药状况较科氏葡萄球菌严重，2种CoNS的耐药率存在一定差异。

表 2 Tab.2

表 2 2种主要CoNS耐药率统计 Tab.2 Resistant frequency of two major CoNSisolates to 15 antibiotics 抗菌药物 （antimicrobial agent） 2种主要CoNS菌株的耐药率 （resistance rate of two main CoNS species）/% 科氏葡萄球菌 （S.cohnii），n=33 表皮葡萄球菌 （S.epidermidis），n=27 青霉素（penicillin） 93.9 96.3 红霉素（erythromycin） 84.8 74.1 苯唑西林（oxacillin） 84.8 55.6 头孢西丁（cefoxitin） 81.8 88.9 四环素（tetracycline） 30.3 11.1 复方新诺明（sulfamethoxazole） 18.2 22.2 克林霉素（clindamycin） 15.2 11.1 替考拉宁（teicoplanin） 0 40.7 左氧氟沙星（levofloxacin） 0 14.8 庆大霉素（gentamicin） 0 3.70 万古霉素（vancomycin） 0 0 利福平（rifampicin） 0 0 达托霉素（daptomycin） 0 0 利奈唑胺（linezolid） 0 0 呋喃妥因（nitrofurantoin） 0 0

表 2 2种主要CoNS耐药率统计 Tab.2 Resistant frequency of two major CoNSisolates to 15 antibiotics

药敏分析结果显示，85株CoNS中有81株（95.3%）对1种或多种抗生素耐药，耐药菌株可分为36个耐药谱型（表 3）。其中OXC-ERY-PEN-CFX为最主要的耐药谱型，包含25株，其余耐药谱型包含的菌株数均不高于5株。当细菌对3类或3类以上抗生素同时呈现耐药，称为多重耐药菌，分析耐药谱可知，85株CoNS中多重耐药菌（MDR）共有37株，占43.5%，多重耐药情况严重，主要耐药组合为β-内酰胺类、大环内脂类、多肽类抗生素。本研究共发现10种耐药类型（图 2），其中以耐3种、4种、5种抗生素为主，分别为15.3%、41.2%、16.5%，占全部菌株的73.0%，共发现2株菌对9种抗菌药物同时耐药，分别为表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌。

表 3 Tab.3

表 3 85株CoNS耐药谱型 Tab.3 The antibiotic resistance profiles and its number of 85 CoNS isolates 耐药谱型 （resistance phenotypes） 菌株数 （number of strains） 百分比 （percentage）/% All sensitive 4 4.7 PEN 1 1.18 ERY-PEN 4 4.7 SXT-PEN 1 1.18 OXC-PEN 1 1.18 ERY-PEN-CFX 5 5.88 ERY-TEC-PEN 2 2.35 OXC-PEN-CFX 2 2.35 SXT-PEN-CFX 1 1.18 TEC-PEN-CFX 1 1.18 ERY-SXT-PEN 1 1.18 ERY-TET-PEN 1 1.18 ERY-CLI-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-TET-SXT 1 1.18 ERY-TEC-PEN-CFX 4 4.7 ERY-TET-PEN-CFX 3 3.53 OXC-TET-PEN-CFX 2 2.35 OXC-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-PEN-CFX 25 29.4 OXC-EHY-TEC-PEN-CFX 3 3.53 OXC-KRY-GEN-PEN-CFX 2 2.35 OXC-ERY-TET-PEN-CFX 2 2.35 LEV-TEC-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-TET-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-LEV-TET-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-LEV-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-TET-SXT-PEN 1 1.18 OXC-ERY-CLI-PEN-CFX 2 2.35 ERY-LEV-TEC-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-TEC-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-TET-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-TET-TEC-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-TET-SXT-PEN-CFX 2 2.35 OXC-ERY-CLI-TET-TEC-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-LEV-TET-GEN-SXT-PEN-CFX 1 1.18 OXC-ERY-LEV-GEN-TEC-RIF-SXT-PEN-CFX 1 1.18

表 3 85株CoNS耐药谱型 Tab.3 The antibiotic resistance profiles and its number of 85 CoNS isolates

图 2 85株CoNS多重耐药情况 Fig.2 Distribution of multiple drug resistance types in 85 CoNS

本研究针对从制药企业药品生产环境中收集的85株CoNS，分析了其耐药情况。研究结果表明CoNS主要对青霉素类、头孢菌素类、红霉素类抗生素耐药，耐药率均大于60%，多重耐药菌有37株，占43.5%，主要耐药组合为β-内酰胺类、大环内脂类、多肽类抗生素，特别注意的是有2株菌同时对9种抗生素具有抗性，分别为表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌，同时这2种葡萄球菌为临床感染CoNS主要分离株，而且据国外报道，已有耐万古霉素的溶血葡萄球菌出现^[12]，值得高度关注。

制药企业药品生产环境污染的85株CoNS中耐苯唑西林CoNS 54株，耐药率为63.5%，与临床感染CoNS中耐甲氧西林CoNS（MRCNS）50.0%~85.0%的检出率无明显差异^[13-15]。本研究中CoNS对青霉素的耐药率最高，为94.1%，与临床感染CoNS耐药率^[16]较一致，这可能与青霉素长期大量使用有关。临床感染CoNS对常用的头孢西丁、红霉素、苯唑西林等一线抗革兰阳性球菌的抗菌药物的耐药率超过50%^[17]，与本研究结果一致。临床CoNS对四环素、复方新诺明、克林霉素、左氧氟沙星、庆大霉素等抗生素耐药率为50.6%~76.4%^[18-19]，而本研究中企业药品生产环境污染的CoNS分离株对四环素、复方新诺明、克林霉素、左氧氟沙星、庆大霉素较敏感，可能是由于这5种抗生素在临床上的广泛使用对葡萄球菌造成了一定的环境选择压力，导致耐药率高。临床感染CoNS对利福平耐药率不足5%^[20]，本研究中检出1株葡萄球菌对利福平耐药（1.18%），菌株对利福平的高度敏感性与临床该药物耐药情况相同。

研究表明，国内临床感染葡萄球菌中对糖肽类抗生素替考拉宁100%敏感或高度敏感^[21-22]，而本研究中检出替考拉宁耐药菌株16株（18.8%），中介菌株18株（21.2%），耐药率较高，而且存在着对替考拉宁耐药水平上升的风险。本研究中未发现对利奈唑胺、万古霉素耐药的菌株，临床感染葡萄球菌也对万古霉素、利奈唑胺呈现高度敏感^[23-24]，可知万古霉素、利奈唑胺仍是治疗多重耐药葡萄球菌的有效药物。

本研究中CoNS多重耐药现象严重，可知在制药企业药品生产环境中存在着较高的耐药病原菌污染的风险。CoNS虽为条件致病菌，但是其潜在致病力与耐药病原菌感染的风险不容忽视，而且多重耐药CoNS传播情况严重^[25-27]。药品使用者是患者，药品中污染微生物会严重影响药品安全性，威胁患者健康，尤其是免疫力低下、身体虚弱的住院患者更容易引起感染，导致治疗困难，而耐药病原菌的存在则具有更大风险，因此药品及其生产过程中需严格控制耐药致病菌。制药企业应加强药品生产环境监控和环境菌耐药性监测，加强微生物控制，从源头降低药品微生物尤其是耐药菌污染风险，提高药品质量与用药安全。