中药饮片系指药材经过炮制后可直接用于中医临床或制剂生产使用的处方药品^[1]，中药饮片来源十分广泛，包括天然植物、动物和矿物。作为中医药的重要特色和优势之一，中药饮片的质量优劣直接关系到中医医疗效果以及中药制剂的安全有效。中药饮片在原料来源和炮制加工过程中往往含有大量微生物，微生物不仅会影响其储存和质量稳定，严重的微生物污染尤其是致病微生物，还可引发用药安全问题^[2-3]。因此，制定科学合理的中药饮片微生物限度标准，是保证饮片微生物安全的关键，也是实现中药标准引领国际、中药产业健康发展的关键^[4]。目前，欧洲药典、美国药典和日本药局方均收载了天然药（生药）的微生物检查方法和限度标准。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版四部通则“1107非无菌药品微生物限度标准”亦首次收载了中药饮片的微生物限度标准，但仅针对研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片。《中国药典》2020年版拟新增“中药饮片微生物限度检查法”，并拟对饮片的微生物限度标准进行修订，已公示的“中药饮片微生物限度标准（草案）”基于饮片的给药途径和潜在风险，分级制定了微生物限度标准。

目前，各国药典对于天然药均规定了基于传统培养的微生物限度检查方法。我国的多位学者采用传统培养方法对多种中药饮片的微生物污染情况进行了研究^[5-9]。但是，传统培养技术往往只能获得1%左右甚至更低比例的可培养微生物^[7]，对于全面了解中药饮片污染微生物的多样性及群落构成是远远不够的。随着高通量测序技术的发展成熟和低成本化，其已成为当前研究环境微生物多样性及群落结构差异的重要技术手段^[10]。因此，本研究以6类中药饮片为研究对象，采用16S rRNA高通量测序技术对中药饮片污染的微生物类群进行研究，同时基于《中国药典》2015年版的规定对待测饮片进行控制菌检查，以期进一步了解中药饮片微生物污染的实际情况和致病风险，为中药饮片微生物限度标准的完善及微生物污染的控制提供支持和依据。

1 材料 1.1 主要仪器

Miseq核酸测序仪（Illumina公司）；Qubit 3.0荧光定量仪（赛默飞公司）；ABI 9700型PCR扩增仪（ABI公司）；VITEK 2 Compact全自动微生物生化鉴定系统（Biomerieux公司）；琼脂糖凝胶电泳仪及成像系统（BioRad公司）；LABGARD型生物安全柜（NuAire公司）。

1.2 主要试剂

Nextera DNA Flex文库制备试剂盒（Illumina公司）；MiSeq Reagent Kit v3（2×300 cycle）测序试剂盒（Illumina公司）；dsDNA HS Assay Kit for Qubit（Invitrogen公司）；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、Premix TaqTM DNA聚合酶试剂盒（TAKARA，大连宝生物工程有限公司）。

2 实验方法 2.1 中药饮片样品的采集

本研究选取柴胡、黄芪、枸杞子、铁皮枫斗、桔梗、土鳖虫共计6个中药饮片品种，每个品种10个批次。对于每个品种，尽可能选择不同的生产单位，以便研究数据具有更好的代表性。共收集中药饮片样品60批，具体信息见表 1。

2.2 供试品溶液的制备

每批抽取不少于100 g样品粉末，混合均匀。称取样品粉末25 g，加入0.9%无菌氯化钠溶液225 mL，用均质器拍打1~2 min，静置1 min后，取上清液作为1:10供试品溶液。

2.3 控制菌检查

本研究所选6类中药饮片均为需煎煮的饮片，参照《中国药典》2015年版< 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 > ，进行耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌的检查。

2.3.1 耐胆盐革兰阴性菌检查

取10 g样品用胰酪大豆胨液体培养基（TSB）制备成1:10供试品溶液，混匀，20~25 ℃培养2 h。取相当于l g样品的上述预培养物接种至100 mL肠道菌增菌液体培养基中，30~35 ℃培养24~48 h后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30~35 ℃培养18~24 h。

2.3.2 沙门菌检查

取10 g样品接种至200 mL TSB中，混匀，33 ℃培养18~24 h。取上述培养物0.1 mL，接种至10 mL RV沙门增菌液体培养基中，33 ℃培养18~24 h。取少量RV沙门菌增菌液体培养物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33 ℃培养18~48 h。

2.3.3 菌落鉴定

挑取上述紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基和木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基上生长的不同形态特征的微生物菌落，划线接种于TSA平板进行分离纯化。采用VITEK生化鉴定系统，对纯化后的微生物进行鉴定。

2.4 16S rRNA高通量测序 2.4.1 16S rRNA序列扩增和测序

采用Illumina Miseq高通量核酸测序平台，直接对未经培养的6类中药饮片的60批样品中污染的微生物类群进行分析。对“2.2”项下制备的供试品溶液，采用TAKARA细菌基因组试剂盒，提取污染微生物DNA，作为测序模板。采用两步PCR扩增方法构建测序文库，针对16S rRNA的V4-V5区，采用引物515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和926R 5’-CCGTCAATTCMTTTGAG TTT-3’，进行PCR扩增^[12]。琼脂糖凝胶电泳检测后，对PCR阳性扩增产物，采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行回收。以回收的PCR产物为模板，采用5’Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’的融合引物，进行二次PCR扩增加入测序标签，用AMPure XP beads纯化各样品PCR产物。用Qubit 3.0 fluorometer对纯化PCR产物进行定量分析，均一化混均后，采用MiSeq Reagent Kit v3（2×300 cycle）芯片进行测序。

2.4.2 序列处理和分析

测序完成后，根据barcode条形码信息拆分各个样本的数据，并对序列质量进行质控和过滤，只有当原始序列中含有完整的barcode标签序列时，该条序列才被认可为有效序列。基于PE reads之间的overlap关系进行拼接，拼接后的序列再次进行质控过滤，去除非特异性扩增并含有模糊碱基、单碱基高重复区的序列，以及PCR过程产生的一些嵌合体。序列质控采用Trimmomatic软件，序列拼接采用FLASH软件。利用USEARCH软件，将优化拼接好的序列进行OTU（operational taxonomic units）聚类分析，得到OTU代表序列后，通过Mothur软件将OTU代表序列与数据库比对，进行物种信息注释（设定阈值为0.8），获得分类学信息^[13]，并分别在各个分类单元统计各样本的群落组成及物种丰度信息。

3 实验结果 3.1 控制菌检查

60批中药饮片样品的耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌的检查结果如表 2所示。其中，耐胆盐革兰阴性菌在28批样品中检出，而沙门菌在所有样品中均未检出。不同类别中药饮片中耐胆盐革兰阴性菌检出率差异较大，仅经过净制、干燥炮制工艺的饮片耐胆盐革兰阴性菌的污染率较高，如柴胡样品中检出率达90%，黄芪、枸杞子、桔梗样品中检出率也在50%以上；而炮制工艺包含热处理的铁皮枫斗和土鳖虫样品中的耐胆盐革兰氏阴性菌的污染率较低，分别为0和10%。

3.2 菌落鉴定分析

紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基和木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基上微生物菌落的鉴定结果如表 3所示。不同饮片品种中污染的微生物均属于变形菌门，分布于6个科，14个属。其中检出比例最高的为肠杆菌科，其次为假单胞菌科。不同饮片样品中检出的污染微生物种类具有明显的差异，柴胡和黄芪样品中检出8种污染菌，铁皮枫斗样品中仅能检出一类泛菌属细菌，而其他饮片品种中则至少能检出3种以上的污染菌。值得关注的是，本研究从6类中药饮片中检出了阪崎克罗诺杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等重要的条件致病菌。

3.3 微生物群落特征的高通量测序分析

通过Miseq测序平台对6类中药饮片污染微生物的多样性进行分析，分别成功从10批柴胡、10批黄芪、5批枸杞子、6批铁皮枫斗、10批桔梗和10批土鳖虫样本的1:10供试品溶液中，获得有效PCR扩增及高通量测序。不同饮片获得的有效序列信息如表 4所示，其中桔梗样品中获得了最多的有效序列（186 748条），其次为柴胡（168 998条），铁皮枫斗获得的有效序列最少（86 073条），序列的平均长度为412 bp。在97%相似度下，将有效序列进行OTUs聚类分析，所有样品中共计产生584个OTUs，其中柴胡中OTUs种类最多（390个），其次是土鳖虫（280个），铁皮枫斗的OTUs个数最少（174个）。

利用Mothur软件做Rarefaction分析，制作稀释曲线（图 1-A）。由图可知，随着测序序列数目的增加，测序样品的曲线基本趋于平稳，表明测序数据量渐进合理，能够真实反映样品中的细菌群落构成。图 1-B是丰度等级图，能够反映测序样本的物种丰度和均匀度。从图 1-B可知，不同饮片样本之间的物种丰度和均匀度具有明显差异。

根据不同饮片样品中OTU分类学注释结果，分别在门和属水平下进行污染微生物相对丰度的统计分析。从图 2可知，不同类别饮片中污染菌多集中于变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes。一些细菌门类群在不同类别饮片中的分布具有差异，如蓝藻细菌门Cyanobacteria主要分布于柴胡、黄芪、枸杞子和桔梗中。放线菌门Actinobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes则分布于除土鳖虫外的其他5种饮片品种中，而浮霉菌门Planctomycetes仅可在枸杞子和铁皮枫斗中检测到。

不同类别中药饮片样品中污染微生物属水平类群的比较分析如图 3所示，细菌相对丰度大于1%的细菌属共计27个，其中在柴胡中发现7个，黄芪中9个，枸杞子中9个，铁皮枫斗中9个，桔梗中9个，土鳖虫中5个。进一步分析发现，不同中药饮片品种中的优势菌属具有明显差异，其中柴胡、铁皮枫斗和桔梗样品中的优势菌属为泛菌属Pantoea，黄芪中的优势菌属为魏斯氏菌Weissella，枸杞子为链球菌Streptococcus，而土鳖虫为立克次氏体Rickettsiella。

4 讨论 4.1 不同类别中药饮片中耐胆盐革兰阴性菌污染差异分析

控制菌检查是传统微生物限度检查法评估污染微生物风险的主要方式。本研究参照《中国药典》2015年版，对柴胡、黄芪、枸杞子、铁皮枫斗、桔梗和土鳖虫共6类中药饮片样品进行了耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌检查。结果显示，47%的中药饮片样品中检出耐胆盐革兰阴性菌，而沙门菌均未检出。不同类别中药饮片中耐胆盐革兰阴性菌的检出率差异较大，且经过净制、干燥等简单炮制工艺的饮片中耐胆盐革兰阴性菌检出率远高于炮制工艺包含热处理的饮片，说明耐胆盐革兰阴性菌污染情况的差异可能与饮片的加工炮制工艺相关。甘永琦等^[7]的研究也发现，“切碎”和“炮炙”两类饮片中耐胆盐革兰阴性菌污染具有显著差异，经过“炮炙”的饮片样品中耐胆盐革兰阴性菌的污染量均 < 10 cfu·g^-1。因此，切制、净制、干燥等简单炮制工艺的中药饮片更需注意加工过程中的微生物污染控制。

4.2 中药饮片中重要条件致病菌的污染情况

肠杆菌科、假单胞菌属和气单胞菌属被认为是最主要的耐胆盐革兰阴性菌的来源，包含了多种致病菌和条件致病菌^[14]。与前期研究结果一致，本研究采用传统控制菌检查法，发现紫红胆盐葡萄糖琼脂和木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上分离的微生物菌落主要隶属于肠杆菌科、假单胞菌属等。其中，检出的阪崎克罗诺杆菌、奇异变形杆菌为肠杆菌科的致病菌或条件致病菌，可引发不同程度的肠道疾病^[15]，由此可见，直接口服类饮片对耐胆盐革兰阴性菌的控制十分必要。此外，检出的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、溶血不动杆菌、鲍氏不动杆菌等属于重要的条件致病菌，可引发呼吸道疾病、血液感染、皮肤伤口感染等^[16-18]。这些微生物虽然通过口服引起疾病的可能性很小，但它们的存在提示着外用类饮片可能存在着一定的用药风险，并且在饮片加工和使用过程中还存在交叉污染的可能和感染从业人员的风险。

4.3 不同中药饮片中微生物群落组成差异分析

本研究基于16S rRNA高通量测序方法，研究了6类中药饮片品种中污染微生物群落组成的多样性。变形菌门和厚壁菌门是污染中药饮片的主要优势群落，特别是变形菌门的微生物群落（大多为革兰阴性菌），占到了中药饮片中微生物污染量一半以上。值得注意的是，具有一定致病性微生物的链球菌属、肠球菌属和葡萄球菌属在中药饮片中也占有一定的比例。此外，不同中药饮片品种中污染微生物群落的组成具有一定差异，这可能跟中药饮片本身和原始生长环境具有相关性。蓝藻门微生物群落主要分布于来自植物根部的中药饮片品种中^[19]，如柴胡、黄芪和桔梗都是来自于植物的根部，根部与泥土密切接触，易携带蓝藻门微生物群落。此外，立克次氏小体属占到了土鳖虫微生物群落的80%以上，在其他中药饮片品种中几乎没有分布，而有研究表明，立克次氏小体属主要寄生于节肢动物中^[20]。

4.4 16S rRNA高通量测序在微生物群落研究中的优势

基于16S rRNA高通量测序微生物多样性分析，未经过增菌培养，直接从6类中药饮片中获得了6个主要门类群和27个属类群的微生物群落信息。而通过传统微生物培养方法，仅能分离获得1个门类群，14个属类群的污染微生物信息。相较于传统培养法，基于16S rRNA高通量测序方法能够获得更加全面的中药饮片中污染微生物群落信息，特别是一些传统培养无法获得的微生物群落，本研究发现的立克次氏小体属，以及污染量较低的微生物^[21]，如沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、嗜血杆菌属等相对丰度在1%以下微生物在传统培养方法中未获得相应的信息。

4.5 16S rRNA高通量测序在微生物群落风险评估中的不足

中药饮片一些加工工艺，如炮炙，会导致饮片样品中污染微生物失活。而16S rRNA高通量测序通常针对样品中所有的DNA，死的微生物也可能被检测到，因此，16S rRNA高通量测序需与传统培养方法相结合才能更准确地评估中药饮片样品中污染微生物的风险。16S rRNA高通量测序选择测序目标区域的不同，也会对测序结果产生影响，如Hong等^[22]研究发现，当在97%水平下定义OTU时，测序区选择V4-V5区产生的误差值最小（3%），V3区（5.2%）次之。因此，鉴于16rRNA基因结构的复杂性，运用多种分子生物学方法相结合，才能更全面地评估样品中微生物种群多样性。此外，16S rRNA高通量测序会产生大量的数据，加大了研究者对高通量测序结果分析的难度，若选择数据分析方法不可靠，也会对高通量测序结果的准确性带来偏差，所以应当谨慎地选择数据分析方法和策略，保证测序结果的准确性。

综上，16S rRNA高通量测序方法能够对中药饮片样本中污染微生物多样性进行快速、全面的分析，但受限于方法本身的分辨能力和样本微生物污染水平等因素，还需与传统培养方法相结合才能够更加全面地评估中药饮片污染微生物的风险。此外，多种重要条件致病菌的检出提示，中药饮片污染微生物具有一定的致病风险。因此，十分有必要通过合理的中药饮片微生物限度标准引导饮片企业加强生产过程的管理和控制，从而有效防范中药饮片的微生物致病风险，提高中药饮片质量安全。