2019, Vol. 39 
洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰阴性细菌，也是制药用水系统中最常见的污染菌，可以促进生物膜的形成。2010-2018年期间，美国FDA非无菌药品的召回事件中，由洋葱伯克霍尔德菌引起的事件占比约1/3。为加强药品监管，保障药品质量，美国药典编制议案中正在进行“非无菌产品的微生物检验：洋葱伯克霍尔德菌复合物的检测”相关研究工作，拟新增相关章节[1-2]。
伯克霍尔德菌属（Burkholderia）是伯克氏菌科的一个属，为革兰阴性杆菌，其中洋葱伯克霍尔德菌最为常见，该菌株的最适合生长温度为30℃，有动力，赖氨酸、枸橼酸盐、吲哚、H2S阳性，能够氧化葡萄糖、麦芽糖，不还原硝酸盐；该菌株是引起囊性纤维化（cysticfibrosis，CF）的重要条件致病菌，可引发败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、脓肿、眼结膜炎等多种医院内感染；对常用抗菌防腐剂具有耐受性；对多粘菌素、庆大霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物天然耐药[3]。
《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）是细菌分类鉴定的金标准[4]，伯克霍尔德菌属共收载16个“种”的菌株信息，其中洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、多噬伯克霍尔德菌（Burkholderia multivorans）、稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）、越南伯克霍尔德菌（Burkholderia vietnamiensis）等隶属于洋葱伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex，BCC），是目前的关注热点。BCC是伯克霍尔德菌属内一类表型近似，但在基因型上存在差异的菌群总称，由于此类菌株的表型极其相似，BCC无法通过常规的显微镜检、生化鉴定等表型鉴定手段鉴别区分，对于它们的分类学多基于基因型鉴定水平。由于伯克霍尔德菌属16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA）基因序列的同源性高达98%~100%，导致以16S rRNA基因作为通用鉴定靶点的方法存在局限性，难以进行“种”水平的鉴定[5]。定位于基因组上的保守性、单拷贝功能基因序列是进行菌株“种”水平鉴定的良好靶点，其中以DNA促旋酶亚基B（DNA gyrase subunit B，gyrB）基因较为常见，以gyrB基因为靶点，开展短乳杆菌[6]、霍乱弧菌和副溶血弧菌[7]、地衣芽孢杆菌[8]、克罗诺杆菌[9]等种属的鉴定和分类研究已被广泛报道，但未见其在伯克霍尔德菌属内菌株鉴定的相关研究。
本文建立伯克霍尔德菌属典型菌株gyrB基因序列鉴定方法，并对菌株鉴定的gyrB基因特征序列进行聚类分析，评价鉴定水平，为该菌属污染物的鉴定和分类提供研究思路和方法依据。
1 材料与方法 1.1 试验菌株洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、热带伯克霍尔德菌（Burkholderia tropica）、污染伯克霍尔德菌（Burkholderia contaminans）、乌拉姆伯克霍尔德菌（Burkholderia unamae）、含羞草结瘤伯克霍尔德菌（Burkholderia nodosa）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；越南伯克霍尔德菌（Burkholderia vietnamiensis）购自北纳生物科技有限公司。试验菌株采用革兰染色、生化反应、核糖体分型等多相分类鉴定方法，确证菌株遗传背景。
1.2 主要仪器与试剂VITEK全自动微生物生化鉴定系统（Biomerieux公司）；RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统，及配套EcoR Ⅰ试剂套装（DuPont公司）；ABI 9700型PCR扩增仪（ABI公司）；琼脂糖凝胶电泳仪及成像系统（BioRad公司）；MIR-254型培养箱（SANYO公司）；LABGARD型生物安全柜（NuAire公司）。
胰酪胨大豆琼脂平板（TSA，Biomerieux公司）；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、Premix TaqTMDNA聚合酶试剂盒（TAKARA，大连宝生物工程有限公司）；POP-7 Ploymer、BDT V3.1 SEQ Buffer等核酸测序试剂（Lifetech公司）；其他化学试剂均为分析纯。
1.3 伯克霍尔德菌gyrB基因序列片段扩增 1.3.1 PCR扩增引物正向引物（gyrB forward）：5’-CCSACSGACGTGAAGATG-3’；反向引物（gyrB reverse）：5’-TCCACTGCATSGCGACTTC-3’。
1.3.2 PCR扩增体系20 μL，其中Premix 10 μL、基因组DNA 0.5 μL、引物各0.25 μL、ddH2O 9 μL。
1.3.3 PCR反应条件94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。
1.4 核酸测序鉴定将PCR产物纯化后进行单链扩增。扩增体系：20 μL，其中PCR产物1 μL，引物（3.2 pmol）4 μL，BigDye（2.5×）8 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件：96 ℃ 1 min，96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，25个循环，4℃保温。采用试剂盒（BigDye XTerminator Purification Kit）纯化单链扩增产物后，按照核酸测序仪标准操作规程操作，上机测序。
1.5 聚类分析采用Mega 5.0分析软件进行核酸序列的比对与系统进化分析，以“Neighbor Joining Clustering Method”方法进行序列比对；以Bootstrap Method（1 000）、Kimura 2-Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计学计算方式，构建N-J进化树（neighbor-joining tree），聚类分析各个种属之间的进化关系[10]。
2 实验结果 2.1 伯克霍尔德菌属菌株遗传背景确认选择伯克霍尔德菌属内6个“种”7株标准菌株，分别采用VITEK生化鉴定和Ribotyping核糖体分型方法，对收集的菌株进行多相分类鉴定，确认菌株遗传背景（表 1），结果显示VITEK生化鉴定结果中，洋葱伯克霍尔德菌、污染伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌能够鉴定到“属”的水平，由于VITEK系统数据库的局限性，热带伯克霍尔德菌、乌拉姆伯克霍尔德菌、含羞草结瘤伯克霍尔德菌未获得明确的鉴定信息；Ribotyping核糖体分型鉴定结果中，不同菌株的核糖体分型图谱各不相同，可聚类为2个分支（图 1），洋葱伯克霍尔德菌和越南伯克霍尔德菌聚类为1个支，污染伯克霍尔德菌、热带伯克霍尔德菌、乌拉姆伯克霍尔德菌、含羞草结瘤伯克霍尔德菌聚类为1个支，图谱鉴定结果显示洋葱伯克霍尔德菌可以鉴定到“种”的水平；热带伯克霍尔德菌、乌拉姆伯克霍尔德菌未获得明确的鉴定信息；其他菌株均指向洋葱伯克霍尔德菌（与菌种信息不一致），且鉴定图谱的相似度均小于0.80。对于多相分类鉴定结果不一致，或者无法确认菌株遗传背景的菌株，采用通用引物进行16S rRNA基因测序，将获得的序列与Genbank数据库进行比对，获得参比序列（RefSeq），间接佐证菌株的遗传背景。
|
表 1 伯克霍尔德菌属菌株多相分类鉴定结果统计 Tab.1 Bacterial multiphase identification of Burkholderia in this study |
|
图 1 伯克霍尔德菌Ribotyping鉴定图谱 Fig.1 Ribotyping identification of Burkholderia |
将遗传背景确认的伯克霍尔德菌进行核酸测序鉴定，获得经校核的高质量核酸序列，将菌株鉴定的gyrB基因特征序列生成fasta文件；同时，为了评估该基因序列片段在“属”内“种”的鉴定水平，从Genbank数据库下载伯克霍尔德菌属常见菌株的gyrB基因参比序列，一并导入采用Mega 5.0序列分析软件，以Bootstrap Method（1 000）、Kimura 2- Parameter Model、Uniform Rates、Pairwise Deletion的统计学计算方式，构建菌株鉴定与分类拓扑结构图（如图 2）。聚类分析结果显示洋葱伯克霍尔德菌、污染伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌、热带伯克霍尔德菌、乌拉姆伯克霍尔德菌和含羞草结瘤伯克霍尔德菌鉴定的gyrB基因特征序列在“种”的水平均具有特异性；“属”内其他洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）、多噬伯克霍尔德菌（Burkholderia multivorans）、唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）、稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）等常见菌株的序列也各自具有特异性，提示该特征核酸序列对于伯克霍尔德菌的鉴定可以达到“种”的水平。
|
图 2 伯克霍尔德菌gyrB基因特征序列鉴定聚类进化拓扑图 Fig.2 Dendrogram of gyrB gene sequence of Burkholderia |
本文以伯克霍尔德菌为研究对象，建立了该菌属gyrB基因特征序列鉴定方法，并对“属”内“种”间的聚类关系与系统进化进行了分析探讨，为菌株污染物的鉴定和分类提供研究思路和方法依据。
3.1 伯克霍尔德菌属内菌株的鉴定与系统进化地位仍在研究伯克霍尔德菌隶属于伯克氏菌科，其中洋葱伯克霍尔德菌复合体（BCC）是该属内的典型菌群，包括洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌、稳定伯克霍尔德菌和越南伯克霍尔德菌等，随着基因型（genomovar）分类概念的引入，越来越多的BCC菌群被发现并重新定义；另外，洋葱伯克霍尔德菌曾命名为洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia），是20世纪90年代由假单胞菌属中隶属于系统发育系rRNA Ⅱ型的菌株中重新分类而来[4]。因此从物种分类学的研究角度，伯克霍尔德菌属内菌株的分类与系统分类定位仍在研究过程中。本文为建立伯克霍尔德菌gyrB基因特征核酸序列鉴定方法，针对性地选择了目前明确归属为BCC的洋葱伯克霍尔德菌和越南伯克霍尔德菌；归属为伯克霍尔德菌属的热带伯克霍尔德菌和污染伯克霍尔德菌；可能归属为伯克霍尔德菌属或类伯克霍尔德菌属的乌拉姆伯克霍尔德菌和含羞草结瘤伯克霍尔德菌，在相同实验条件下开展研究，保证方法有效性和结果准确性；此外，Ribotyping鉴定结果将试验菌株分成2个支，分别为归属BCC的洋葱伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌和不在BCC群内的污染伯克霍尔德菌、热带伯克霍尔德菌、乌拉姆伯克霍尔德菌、含羞草结瘤伯克霍尔德菌，也间接证实了各菌株的分类定位以及gyrB基因特征核酸序列在“种”水平的特异性。
3.2 基于gryB基因的特征核酸序列适用于伯克霍尔德菌“属”内常见“种”的鉴定伯克霍尔德菌属内菌株的表型极为相似，且“属”内“种”间16S rRNA基因核酸序列的同源性较高，缺乏客观、准确、有效的鉴定方法。重组酶A基因（recombinase A gene，recA gene）最早用于BCC菌群的鉴定与分类[11]；gyrB基因和RNA聚合酶亚基D（RNA polymerase subunit D，rpoD）基因也被报道用于假单胞菌属、伯克霍尔德菌属内部分菌株的鉴定[12-13]。为建立伯克霍尔德菌“属”内“种”水平的通用鉴定方法，本研究分别下载了Genbank数据库中gyrB基因、recA基因和rpoD基因的核酸序列，采用Blast比对方法评估各鉴定靶点的序列特异性，结果表明recA基因适用于BCC菌群的鉴定，但用于热带伯克霍尔德菌、乌拉姆伯克霍尔德菌和含羞草结瘤伯克霍尔德菌等菌株鉴定时，未找到通用的序列保守区设计核酸扩增和测序引物；rpoD基因也未找到适用于整个“属”水平的鉴定位点；综合评估核酸序列特异性、方法通用性等因素，选择gyrB基因序列用于伯克霍尔德菌属的鉴定。由于gyrB基因是定位于基因组的保守性、单拷贝功能基因，可应用于“属”内近缘“种”的鉴定，但不同种属之间的序列差异性较大，故该方法应用于其他种属鉴定时，还需对该DNA特征序列片段及测序引物的特异性进行评估。
| [1] |
USP 41-NF 36[S].2019: 1419
|
| [2] |
中华人民共和国药典2015年版.四部[S].2015: 393 ChP 2015. VolⅣ[S].2015: 393 |
| [3] |
赵艳华. 洋葱伯克霍尔德菌研究进展[J]. 国际检验医学杂志, 2006, 27(7): 651. ZHAO YH. Advances in research on Burkholderia cepacia[J]. Int J Lab Med, 2006, 27(7): 651. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2006.07.027 |
| [4] |
PAUL DV, GARRITY GM, JONES D, et al. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.VolⅡ[M]. Berlin: Springer Berlin Heidelberg, 2011: 575.
|
| [5] |
ESHWAR M, JOCELYN B, SEAN K, et al. DNA-based diagnostic approaches for identification of Burkholderia cepacia complex, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia multivorans, Burkholderia stabilis, and Burkholderia cepacia genomovars Ⅰ and Ⅲ[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(9): 3165. |
| [6] |
赵敏, 潘劲草, 李学梅, 等. 短乳杆菌gyrB基因的扩增与测序[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(8): 1378. ZHAO M, PAN JC, LI XM, et al. Amplification, cloning and sequencing of gyrB gene of Lactobacillus brevis[J]. Chin J Health Lab Technol, 2007, 17(8): 1378. DOI:10.3969/j.issn.1004-8685.2007.08.013 |
| [7] |
侯晓丽, 曹清毅, 潘劲草, 等. 霍乱弧菌和副溶血弧菌分离株的gyrB基因系统发育分析[J]. 微生物学报, 2006, 46(6): 884. HOU XL, CAO QY, PAN JC, et al. Classification and identification of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus isolates based on gyrB gene phylogenetic analysis[J]. Acta Microbiol Sin, 2006, 46(6): 884. DOI:10.3321/j.issn:0001-6209.2006.06.006 |
| [8] |
李宏, 吴海武, 孟凡同. 基于gyrB基因的地衣芽孢杆菌PCR快速检测方法的建立[J]. 海南大学学报(自然科学版), 2013, 31(3): 230. LI H, WU HW, MENG FT. Development of a PCR method for rapid detection of bacillus licheniformis based on gyrB gene[J]. Nat Sci J Hainan Univ, 2013, 31(3): 230. DOI:10.3969/j.issn.1004-1729.2013.03.007 |
| [9] |
陈万义, 艾连中, 任婧, 等. 婴儿配方粉中阪崎克罗诺杆菌gyrB基因的多态性分析[J]. 食品科技, 2013, 38(6): 40. CHEN WY, AI LZ, REN J, et al. The gyrB gene sequence analysis for phylogenetic analysis of Cronobacter sakazakii from infant formula powder[J]. Food Sci Tech nd, 2013, 38(6): 40. |
| [10] |
冯震, 李芳, 宋明辉, 等. 16S核糖体RNA基因片段分析及在药品葡萄球菌污染控制应用中的探讨[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(4): 689. FENG Z, LI F, SONG MH, et al. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for identification of Staphylococcus contaminants in pharmaceutical quality control[J]. Chin J Pharm Anal, 2018, 38(4): 689. |
| [11] |
GEORGE W, PETER V, SARA H, et al. Development of a recA gene-based identification approach for the entire Burkholderia genus[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(7): 3917. DOI:10.1128/AEM.71.7.3917-3927.2005 |
| [12] |
SATOSHI Y, HIROAKI K, DAWN L, et al. Phylogeny of the genus Pseudomonas:intrageneric structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes[J]. Microbiology, 2000, 146(10): 2385. DOI:10.1099/00221287-146-10-2385 |
| [13] |
YUKIKO M, HIROSUKE S, AKINORI K, et al. Phylogenetic study and multiplex PCR-baseddetection of Burkholderiaplantarii, Burkholderiaglumae and Burkholderia gladioli using gyrB and rpoD sequences[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2006, 56(5): 1031. DOI:10.1099/ijs.0.64184-0 |