2019, Vol. 39 
医药产业发展迅速，相关产品发生微生物污染的事件也在增加，污染微生物不仅包括细菌，也包括真菌，其中部分真菌还会产生毒性强烈的真菌毒素，因此，一旦发生真菌污染，尤其是产毒真菌污染，会给药品质量以及患者的用药安全带来极大风险[1-4]。为控制药品质量，避免对患者的健康造成危害，《中华人民共和国药典》（2015年版）[5]、USP 41[6]、EP 9.0[7]和JP 17[8]规定需要检查药品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等致病菌，同时明确除限度标准中所列的致病菌外，其他具有潜在危害的微生物也需检查和评估，故药品生产和检验过程中分离的致病菌需被准确鉴定。此外，《中华人民共和国药典》（2015年版）[5]收录了通则 < 2351黄曲霉毒素测定法 > 和通则 < 9305中药中真菌毒素测定指导原则 > 。《中华人民共和国药典》2020年版公示稿则将通则 < 2351黄曲霉毒素测定法 > 修订为 < 真菌毒素测定法 > ，采用质谱方法测定10种真菌毒素；同时将通则 < 9305中药中真菌毒素测定指导原则 > 也进行了修订，扩大了测定的毒素品种。对中药材和饮片中产毒真菌进行的检测、鉴定，能从源头上提示真菌毒素存在的可能性，避免不合格药材饮片流入生产、使用环节，在提升药材饮片及中药制剂的安全性上，效果更为突出。
真菌形态简单，传统的形态鉴定难度大，而且许多真菌的培养物只有菌丝体，不产生任何有性或无性孢子，无法根据形态特征进行菌种鉴定；另外，在自然环境中只有 < 10%的物种可通过分离培养方法获得[9]。利用特征核酸片段进行分子鉴定已成为分子生物学研究的热点，该技术通过选择一段公认，易扩增且相对较短的DNA片断，以核酸测序技术为基础，依靠不同微生物核酸序列的差异实现对微生物经济、快捷、准确的鉴定，同时也便于实现标准化和信息化[10-12]。rRNA基因的内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）和28S rRNA基因的大亚基单元（（large subunit，LSU）序列常用于真菌鉴定[13-19]。
本研究收集常见的产毒真菌如曲霉属、青霉属和镰刀菌属等的菌株，比较rRNA基因的ITS和LSU序列对真菌鉴定与分型的效果，旨在为药品质量控制中产毒真菌的分子鉴定提供依据。
1 菌株、仪器和试药 1.1 菌株试验用标准菌株分别购自美国微生物菌种保藏中心（ATCC）、中国医学菌种保藏管理中心（CMCC）、中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）、广东省微生物菌种保藏中心（GIM）、中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），包括了曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）、单端孢属（Trichothecium）、节菱孢霉属（Arthrinium）、葡萄糖穗霉属（Stachybotrys）、木霉属（Trichoderma）和镰刀菌属（Fusarium）8个属29个种40余个菌株，详细情况见表 1。
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表 1 真菌菌株列 Tab.1 Strains of fungi |
ABI 3500核酸测序仪（ABI公司），琼脂糖凝胶电泳仪（Bio-Rad公司），凝胶成像系统（Bio-Rad公司），光学显微镜（Zeiss公司），核酸浓度测定仪（Eppendorf公司）等。乳酸-苯酚液（国药集团化学试剂有限公司）等菌株显微形态观察相关试剂，Bigdye、POP7胶、HiDi等核酸测序相关试剂（ABI公司），其他化学试剂均为分析纯。真菌基因组DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]。
2 方法 2.1 形态分析使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，将平板倒转，向上接种1点或3点，正置于（25±1）℃恒温培养箱中进行培养。培养后，观察菌落形态，同时取载玻片，加乳酸苯酚液1滴，用接种钩取一小块真菌培养物，置乳酸-苯酚液中，用2支分离针将培养物轻轻撕成小块，然后加盖玻片，置显微镜下观察。
2.2 DNA提取采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒，提取完成的基因组DNA以紫外分光光度法检测核酸的浓度和纯度。
2.3 核酸扩增为了进一步比较不同DNA区域片段对常见产毒真菌的鉴定能力，分别以ITS区和LSU区设计通用测序引物[20-22]，见表 2。
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表 2 真菌PCR引物序列 Tab.2 Sequences of PCR for fungi |
以50 μL建立PCR反应体系，包括10×PCR反应缓冲液5 μL、脱氧核苷三磷酸（dNTPs，2.5 mmol·L-1）4 μL、扩增引物（10 μmol·L-1）各1 μL，1 ng·μL-1的模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶（5U·L-1）0.4 μL，加无菌双蒸水至50 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃，预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，29个循环；72 ℃延伸5 min。配制1%琼脂糖凝胶，吖啶橙（acridine orange，AO）核酸凝胶染色剂染色，在紫外凝胶成像仪上检视。以扩增引物作为测序引物测序。
2.4 序列分析将测序序列导入Mega 7.0序列分析软件，进行聚类分析，构建N-J进化树。
3 结果 3.1 形态特征鉴定丝状真菌采用肉眼观察菌落形态，显微观察菌体形态，不同菌株的菌落形态和菌丝与孢子形态与其属水平特征一致。图 1显示的是代表性产毒真菌菌落生长形态和菌丝孢子的典型特征。
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A、B.炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）C、D.寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）E、F.rubens青霉（Penicillium rubens）G、H.橘青霉（Penicillium citrinum）I、J.长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）K、L.康宁木霉（Trichoderma koningii）M、N.串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）O、P.粉红单端孢（Trichothecium roseum）Q、R. aureum节菱孢霉（Arthrinium aureum）S、T.芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola） 图 1 代表性菌株的培养特性和形态照片 Fig.1 Cultural characteristics and morphological photos of representive strains |
ITS和LSU序列的引物都能将产毒真菌成功扩增出1条清晰的条带，ITS序列长度约500 bp，LSU序列长度约900 bp，代表性菌株的扩增产物电泳图见图 2。
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M. 2 000 bp标记（marker）1. CMCC 98003黑曲霉（Aspergillus niger）2. ATCC 16404巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）3. CICC 40673橘青霉（Penicillium citrinum）4. CICC 13003长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）5. CICC 2620腐皮镰孢（Fusarium solani） 图 2 代表性菌株的PCR产物电泳图 Fig.2 PCR electrophoresis photos of representive strains |
将测序后的序列与公共数据库进行比对，并下载对应的参考序列和ATCC公布的已测序序列，构建得到的N-J进化树如图 3和图 4所示。
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图 3 基于ITS序列构建的N-J进化树 Fig.3 Neighbor-joining tree based on ITS squences |
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图 4 基于LSU序列构建的N-J进化树 Fig.4 Neighbor-joining tree based on LSU squences |
由图 3可知葡萄糖穗霉属、木霉属、镰孢属、单端孢属、节菱孢霉属和链格孢属中的菌株在“属”水平能够很好地聚类成簇，大部分菌株在不同的“种”水平能够各自独立区分。青霉属和曲霉属各菌株在种内序列一致性较高，但在“属”水平两者不能完全区分。另外皱褶青霉与属内其他菌株进化距离较远，查阅资料表明，青霉属内皱褶青霉等种已归类至篮状菌属（Talaromyces）[23-24]。
由图 4可知，不仅葡萄糖穗霉属、木霉属、镰孢属、单端孢属、节菱孢霉属和链格孢属中的菌株在“属”水平能够很好地聚类成簇，青霉属和曲霉属菌株也能在“属”水平很好地区分。但青霉属和曲霉属在“种”水平的区分度低于ITS序列，如，未能将鲜绿青霉和rubens青霉很好区分。与ITS序列的进化分析结果一致，皱褶青霉（篮状菌）在LSU序列与青霉属内其他菌株的进化距离也较远。
3.4 ITS和LSU序列“串联”分析由于ITS序列和LSU序列对青霉属和曲霉属的区分各有特点，因此将2个靶基因的序列进行串联，进一步评价青霉属和曲霉属中菌株的序列，见图 5。从图中可知，在“属”水平聚类成簇，且不同菌株包括4株分离株（TKO4、TK05、02和03），在“种”水平也能很好区分。
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图 5 基于LSU和ITS串联序列构建的N-J进化树 Fig.5 Neighbor-joining tree based on compilation LSU and ITS squences |
基因序列测定是对产毒真菌分类鉴别的重要手段，不像传统鉴定方法那样耗时耗力，标准化的鉴定流程也更为简便快捷。ITS基因序列包括ITS1、5.8S和ITS2区，该序列在进化过程中承受的自然选择压力非常小，进化速率较快，因此存在更多的变异；LSU为核糖体大亚基，位于28S rRNA基因，序列的保守性则相对较大。结果也表明，ITS序列对菌株在“种”水平的区分度较好，LSU序列对菌株“属”水平的区分度高。此外，公共数据库中参考序列的有限性以及序列长度的差异性，也是造成本实验中LSU序列在“种”水平聚类水平相对较低的原因。
由于青霉属和曲霉属菌株的孢子形态有明显差异，因此，ITS序列结合传统形态可以将2个属的菌株区分开。但近几年已有研究人员采用多位点序列（multilocus sequence，MLST）的方法进行真菌菌株的分型[25-26]，该方法需要扩增多个管家基因序列，然后进行分析，但对菌株鉴定缺乏通用性。本实验利用MLST的原理，将ITS和LSU序列进行“串联”，使2个序列的变异性和保守性有机结合，进而将青霉属和曲霉属菌株在“种”水平很好地分类。
虽然皱褶青霉孢子形态与青霉属一致，但是无论是ITS序列还是LSU序列，都提示该菌株与属内其他菌株的进化距离较远，进而发现该菌已经归类至篮状菌属，这也进一步说明DNA序列分析在产毒真菌鉴定中的重要性。
国内外药品受真菌污染的问题一直备受关注，如果药材污染产毒真菌，其繁殖后还将产生真菌毒素，会对人类健康造成更加严重的威胁。本实验证明，ITS和LSU特征序列可以用于药品质量控制中产毒真菌的鉴定，它不仅克服传统方法鉴定真菌困难的问题，也可以实现对药材污染真菌毒素的早期风险预警；同时形成的产毒真菌特征序列可以建立标准化的特征序列数据库，绘制进化分析图，从而更有效地评估不同真菌进化地位及其风险。随着验证菌株的增加和来源信息的扩充，通过ITS和LSU特征序列对真菌的鉴定，还可以进一步了解真菌包括产毒真菌在药材中的分布，更好地进行风险评估，为提升药品质量发挥更大的作用。
| [1] |
FOUAD AM, RUAN D, EI-SENOUSEY HK, et al. Harmful effects and control strategies of aflatoxin B1 produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus strains on poultry:review[J]. Toxins (Basel), 2019, 11(3): 176. DOI:10.3390/toxins11030176 |
| [2] |
PITT JI. Toxigenic fungi and mycotoxins[J]. Br Med Bull, 2000, 56(1): 184. DOI:10.1258/0007142001902888 |
| [3] |
KATERERE DR, STOCKENSTRÖM S, THEMBO KM, et al. Apreliminary survey of mycological and fumonisin and aflatoxin contamination of African traditional herbal medicines sold in South Africa[J]. Hum Exp Toxicol, 2008, 27(11): 793. DOI:10.1177/0960327108099535 |
| [4] |
ADEJUMO TO, HETTWER U, KARLOVSKY P. Survey of maize from southwestern Nigeria for zearalenone, alpha-and beta-zearalenols, fumonisin B1 and enniatins produced by Fusarium species[J]. Food Addit Contam, 2007, 24(9): 993. DOI:10.1080/02652030701317285 |
| [5] |
中华人民共和国药典2015年版.四部[S].2015: 140, 224 ChP 2015.Vol Ⅳ[S].2015: 140, 224 |
| [6] |
USP 41-NF 36[S]. 2018: 5971
|
| [7] |
EP 9.0[S]. 2018: 195
|
| [8] |
JP 17[S]. 2017: 138
|
| [9] |
张宇, 郭良栋. 真菌DNA条形码研究进展[J]. 菌物学报, 2012, 31(6): 809. ZHANG Y, GUO LD. Progress of fungal DNA barcode[J]. Mycosystema, 2012, 31(6): 809. |
| [10] |
DULLA EL, KATHERA C, GURIJALA HK, et al. Highlights of DNA barcoding in identification of salient microorganisms like fungi[J]. J Mycol Med, 2016, 26(4): 291. DOI:10.1016/j.mycmed.2016.05.006 |
| [11] |
SCHINDEL DE, MILLER SE. DNA barcoding a useful tool for taxonomists[J]. Nature, 2005, 435(7038): 17. |
| [12] |
HEBERT PD, GREGORY TR. The promise of DNA barcoding for taxonomy[J]. Syst Biol, 2005, 54(5): 852. DOI:10.1080/10635150500354886 |
| [13] |
HANS PH, STEVEN FH, TIMOTHY JL, et al. Assessment of ribosomal large-subunit D1-D2, internal transcribed spacer 1 and internal transcribed spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically important Aspergillus species[J]. J Microbiol, 2005, 43(5): 2092. |
| [14] |
RAFAEL AO, MICHAEL RF, DOLENA RL, et al. Utility of molecular sequence analysis of the ITS rRNA region for identification of Fusarium spp.from ocular sources[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009, 50(5): 2230. DOI:10.1167/iovs.08-2757 |
| [15] |
SOH-YOUNG O, KI-WOONG N, DEOK-HOON Y. Identification of Acremonium acutatum and Trichothecium roseum isolated from grape with white stain symptom in Korea[J]. Mycobiology, 2014, 42(3): 269. DOI:10.5941/MYCO.2014.42.3.269 |
| [16] |
O'DONNELL K, CIGELNIK E, WEBER N S, et al. Phylogenetic relationships among ascomycetous truffles and the true and false morels inferred from 18S and 28S ribosomal DNA sequence analysis[J]. Mycologia, 1997, 89(1): 48. DOI:10.1080/00275514.1997.12026754 |
| [17] |
MIN XJ, HICKEY DA. Assessing the effect of varying sequence length on DNA barcoding of fungi[J]. Mol Ecol Notes, 2007, 7(3): 365. DOI:10.1111/j.1471-8286.2007.01698.x |
| [18] |
SCHOCH CL, SEIFERT KA, HUHNDORF S, et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for fungi[J]. PNAS, 2012, 109(16): 6241. DOI:10.1073/pnas.1117018109 |
| [19] |
LEELOND BN, HERVE P, IRENE M, et al. 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence an alyses reveal inter-and intraspecific Bifidobacterium phylogeny[J]. Int J Syst Bacteriol, 1996, 46(1): 102. DOI:10.1099/00207713-46-1-102 |
| [20] |
SCORZETTI G, FELL JW, FONSECA A. Systematics of basidiomycetous yeasts:a comparison of large subunit D1/D2 and internal transcribed spacer rDNA regions[J]. FEMS Yeast Res, 2002, 2(4): 495. DOI:10.1111/j.1567-1364.2002.tb00117.x |
| [21] |
ROE AD, RICE AV, BROMILOW SE, et al. Multilocus speices identification and fungal DNA barcoding:insights from blue stain fungal symbionts of the mountain pine beetle[J]. Mol Ecol Res, 2010, 10(6): 946. DOI:10.1111/j.1755-0998.2010.02844.x |
| [22] |
SILVA GA, LUMINI E, COSTA ML, et al. Phylogenetic analysis of Glomeromycota by partial LSU rDNA sequences[J]. Mycorrhiza, 2006, 16(3): 183. DOI:10.1007/s00572-005-0030-9 |
| [23] |
SAMSON RA, YILMAZ N, HOUBRAKEN J, et al. Phylogeny and nomenclature of the genus Talaromyces and taxa accommodated in Penicillium subgenus Biverticillium[J]. Stud Mycol, 2011, 70(1): 159. |
| [24] |
TSANG CC, TANG JYM, LAU SKP, et al. Taxonomy and evolution of Aspergillus, Penicillium and Talaromyces in the omics era-Past, present and future[J]. Comput Struct Biotechnol J, 2018, 16: 197. DOI:10.1016/j.csbj.2018.05.003 |
| [25] |
NORBERT B, JULIUS S. Molecular analysis of Candida glabrata clinical isolates[J]. Mycopathologia, 2010, 170(2): 99. DOI:10.1007/s11046-010-9298-1 |
| [26] |
KELLY LJ, HOLLINGSWORTH PM, COPPINS BJ, et al. DNA barcoding of lichenized fungi demonstrates high identification success in a floristic context[J]. New Phytol, 2011, 191: 288. DOI:10.1111/j.1469-8137.2011.03677.x |