2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 湖南省湘潭市食品药品检验所, 湘潭 411100
2. Hunan Xiangtan Institute for Food and Drug Control, Xiangtan 411100, China
幼泻宁颗粒收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第五册，是由车前草、白术（焦）、炮姜3味中药材加工而成的颗粒剂，具有健脾利湿及温中止泻之功效，主要用于小儿脾失健运消化不良引起的腹泻[1]。该制剂质量标准中仅对该制剂的性状、理化鉴别和颗粒剂项下的通则检查作了规定，有关幼泻宁颗粒质量的研究仅对白术内酯单个成分进行含量测定[2]，难以全面地评价幼泻宁颗粒的整体内在质量。指纹图谱技术是以了解物质多组分的整体功能为基础，具有信息量大和特征强等特点。广泛应用于中药质量评价及控制模式的中药指纹图谱是借助于高效液相色谱法，尽可能地将中药中所含化学成分的种类与数量在同一色谱图上反映出来，从而能够更全面地评价药品质量，反映出药品的真实性和稳定性[3-5]。
为了更全面地控制幼泻宁颗粒的质量，保证疗效，本实验建立了幼泻宁颗粒的指纹图谱，并运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版），对指纹图谱中主要特征峰进行化学指认以及组方中药来源初步确定，为制定和控制幼泻宁颗粒质量提供参考依据。
1 仪器和材料 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，包括G1311A四元梯度泵、G1329A自动进样器、G1314B-DAD检测器、G1316A柱温箱、Agilent-Chemistation数据处理系统）；AUW-220D岛津电子天平；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率500 W，50 kHz）。
1.2 材料对照品：木犀草苷（批号111720-201609，含量94.9%）、木犀草素（批号111520-201605，含量99.6%）、白术内酯Ⅰ（批号111975-201501，含量99.9%）、白术内脂Ⅱ（批号111976-201501，含量99.9%）、白术内酯Ⅲ（批号111978-201501，含量99.9%）均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，使用前无需干燥；对照药材车前草（批号121543-201302，车前科植物车前Plantago asiatica L.干燥全草的粉末）、白术对照药材（批号120925-201611，为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎的粉末）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
用于指纹图谱分析的11批幼泻宁颗粒分别购自3个不同的生产厂家。S1~S4号样品，批号分别为1612B1、1704B2、1710B3、1712B3，每袋6 g，山西晋新双鹤药业有限责任公司；S5~S8号样品，批号分别为20171211、20180218、20180410、20180721，每袋6 g，成都迪康药业有限公司；S9~S11号样品，批号分别为180315、180527、180622，每袋6 g，华润三九（郴州）制药有限公司。
2 方法与结果 2.1 色谱条件[6-8]采用Agilent Zorbax-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~20 min，28%A；20~40 min，28%A→68%A；40~55 min，68%A→85%A；55~60 min，85%A→28%A），流速1.0 mL·min-1，检测波长350 nm（0~40 min，检测木犀草苷及木犀草素）、220 nm（40~60 min，检测白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ），柱温30 ℃，进样量10 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 供试品溶液取装量差异项下的幼泻宁颗粒，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（0.5:35）50 mL，称量，超声处理（功率400 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称量，用盐酸-甲醇（0.5:35）补足减失的量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.2 混合对照品溶液取木犀草苷、木犀草素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的对照品各适量，分别以甲醇制成质量浓度分别为1.328 7、2.502 5、5.065 0、3.345 0、4.030 0 mg·mL-1的对照品储备溶液；再分别精密量取对照品储备溶液各2 mL，置50 mL棕色量瓶中，即得混合对照品溶液。
2.2.3 对照药材溶液取车前草、白术对照药材各约10 mg，精密称定，分别按“2.2.1”项方法同法操作，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得2种单味对照药材溶液。
2.3 指纹图谱方法学考察 2.3.1 精密度试验取批号为1712B3的幼泻宁颗粒（S4号样品），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以6（s）号峰（木犀草素）为参照峰，计算21个共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.01%~0.05%，相对峰面积的RSD在0.55%~2.00%，结果表明仪器精密度良好。
2.3.2 重复性试验取批号为1712B3的幼泻宁颗粒（S4号样品），按“2.2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件，依次测定，记录色谱图。以6（s）号峰（木犀草素）为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.00%~0.06%，相对峰面积的RSD在0.20%~3.50%，结果表明方法重复性良好。
2.3.3 稳定性试验取批号为1712B3的幼泻宁颗粒（S4号样品），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，记录色谱图。以6（s）号峰（木犀草素）为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.00%~0.05%，相对峰面积的RSD在0.08%~3.85%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4 指纹图谱研究 2.4.1 11批幼泻宁颗粒HPLC指纹图谱的建立及共有峰指认按“2.1”项下色谱条件，分别取11批不同厂家幼泻宁颗粒的供试品溶液进样，测定HPLC指纹图谱（见图 1）。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2004A）进行色谱峰的匹配，共标定21个共有峰。从图 1中可以看出木犀草素的色谱峰分离度好，峰面积相对稳定，因此选择6（s）号峰（木犀草素）为参照峰，建立幼泻宁颗粒的对照指纹，见图 2。经与在“2.1”项色谱条件下进样所得的混合对照品溶液色谱图（见图 3）比对后，确认样品图谱中5号峰为木犀草苷（luteolin-7-glucoside）、6（s）号峰为木犀草素（luteolin）、17号峰为白术内酯Ⅰ（atractylenolide Ⅰ）、18号峰为白术内酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ）及19号峰为白术内酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ）。取各对照药材溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，所得色谱图（见图 4）与幼泻宁颗粒色谱图对比分析，5、6（s）号峰来源于车前草，17、18、19号峰来源于白术。21个共有峰的相对保留时间以及相对峰面积结果见表 1、2。
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图 1 11批幼泻宁颗粒HPLC指纹图谱 Fig.1 Fingerprints of 11 batches of Youxiening granules |
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图 2 幼泻宁颗粒对照指纹图谱 Fig.2 Reference fingerprint of Youxiening granules |
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5.木犀草苷（luteolin-7-glucoside）6.木犀草素（luteolin）17.白术内酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ）18.白术内酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ）19.白术内酯Ⅰ（atractylenolide Ⅰ） 图 3 混合对照品色谱图 Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference substances |
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A.车前草（Plantaginis Herba）B.白术（Macrocephalae Rhizoma） 图 4 对照药材照色谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of reference crude drugs |
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表 1 11批幼泻宁颗粒（S1~S11号样品）共有峰相对峰面积 Tab.1 The relative peak area of common peaks in 11 Youxiening granules |
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表 2 11批幼泻宁颗粒（S1-S11号样品）共有峰相对保留时间 Tab.2 The relative retention time of common peaks in 11 Youxiening granules |
将11批次不同厂家幼泻宁颗粒样品指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2004A），时间窗宽度设为0.3 min，利用中位数法，以S4号样品色谱图为参照图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成对照图谱，以此作为幼泻宁颗粒的对照指纹图谱，进行相似度评价，计算S1~S12号样品的相似度分别为0.996、0.998、0.999、0.997、0.979、0.978、0.982、0.985、0.992、0.995、0.991，均大于0.95，说明不同厂家的幼泻宁颗粒各批次之间有较好的一致性，质量比较稳定。
3 讨论 3.1 提取溶剂和方法的考察本实验考察了不同比例的溶剂（甲醇、甲醇-水、盐酸-甲醇）和不同提取方式（索氏提取、回流提取、超声提取）对分析结果的影响，见图 5、6。结果表明用盐酸-甲醇提取幼泻宁颗粒，色谱峰成分检出最多，谱图展示度最好；不同提取方式所得的色谱图相差不大，而超声提取操作简单，最终选取超声提取作为提取方式。
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A.盐酸-甲醇（hydrochloric acid-methanol）B.甲醇-水（methanol-water）C.甲醇（methanol） 图 5 幼泻宁颗粒经不同溶剂超声提取的图谱 Fig.5 Chromatograms of Youxiening granules by ultrasonic extraction with different solvents |
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A.超声提取（ultrasonic extraction）B.回流提取（reflow extraction）C.索氏提取（Soxhlet extraction） 图 6 幼泻宁颗粒经不同提取方式的HPLC指纹图谱 Fig.6 Chromatograms of Youxiening granules after different extraction methods |
本实验采用不同品牌色谱柱（Agilent Zorbax-C18、SHIMADZU VP-ODS、Sunfire C18，规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm）、不同仪器（Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1100高效液相色谱仪）、不同流速（0.8、1.0、1.5 mL·min-1）、不同温度（25、30、35 ℃），在这些条件组合下进行实验，结果表明，木犀草苷、木犀草素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ在不同仪器、不同色谱柱、不同流速及不同温度条件下分离度良好，对上述5个成分的分离度无明显影响。
3.3 测定主要目标成分的选择幼泻宁颗粒由车前草、白术等中药组成：车前草主要含有木犀草素和木犀草苷等黄酮类化合物[9-10]；白术主要以挥发油及内酯类为主要活性成分，包括白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ等[11-13]。木犀草苷、木犀草素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ 5个有效成分具有显著的健脾益气、燥湿利水、暑湿泄泻、热淋涩痛的作用，与幼泻宁颗粒治疗小儿脾失健运消化不良引起的腹泻的作用关联很大，为了全面控制幼泻宁颗粒的内在质量，笔者选择对这5个成分进行了确认测定。
3.4 小结本研究建立了幼泻宁颗粒HPLC指纹图谱，共发现21个共有峰，方法学考察符合要求。通过与对照药材色谱图对比，对部分色谱峰进行了归属，并用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）进行相似度分析，11批制剂的相似度均大于0.95，结果表明11批制剂间相似度高，所建立的指纹图谱能较全面地反映制剂中的整体物质，为控制该药质量提高提供参考依据。
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