重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）是利用基因重组技术，通过中国仓鼠卵巢细胞（CHO）高效表达的一种具有高度糖基化的重组蛋白。临床上主要用于治疗肾性贫血^[1-2]。其结构中包括3个N-糖以及1个O-糖位点，糖的比例约占总相对分子质量的40%。N-糖链主要由甘露糖、岩藻糖、唾液酸等单糖组成^[3-4]，特别是N-糖的末端，均有不同程度的唾液酸化^[5-7]。糖基化的微观不均一性，是判定rhEPO药物生物活性高低的关键因素之一。实验证明，rhEPO的糖基化程度不仅对于其在体内的活性具有重大影响^[8]，而且关乎药物的药理药效以及用药安全性。因此，rhEPO的糖基化分析是该药质控及安全性评价的重要指标。

目前，寡糖分析的手段有很多种，其中常见的是将寡糖链从糖蛋白上酶解下来，再使用荧光标记物如2-氨基苯酰胺（2-AB）或2-氨基苯甲酸（2-AA），及8-氨基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐（APTS）等对寡糖链进行标记，之后再使用分离分析技术如毛细管电泳（CE）和高效液相色谱（HPLC）手段，对荧光标记的寡糖链进行分析^[9-10]。APTS是一种有强绿色荧光的水溶性试剂，可以与经重组N-糖苷酶（PNGaseF）酶切下来的N-寡糖末端等比例结合，使寡糖样品带上荧光标签的同时带上电荷，易于进行电泳分离，已广泛应用于电泳中糖类物质的检测^[11-12]。

CE技术适合极性物质的分离，在对寡糖链的分析中具有一定的优势，可实现寡糖的高分辨分离^[13]。已报道的CE分析方法一般分离时间较长（大于40 min）。本研究基于CE的技术手段，采用APTS对rhEPO的N-寡糖进行荧光标记，利用激光诱导荧光（laser induced fluorescence，LIF）检测器，建立了一种更加快速的N-寡糖分析方法，5.5 min即完成分离检测，同时利用快速糖分析试剂盒中的糖型内标和GU数据库对糖型进行实时鉴定。

1 仪器与试药 1.1 毛细管电泳系统

PA800 Plus毛细管电泳系统（Sciex公司）；32 Karat软件，Version 10.0，带有GU数据库（Sciex公司）；激光诱导荧光检测器，激发波长488 nm，检测波长520 nm。紫外分光光度计DU800（BeckmanCoulter公司）；金属浴温控系统H₂O³（国产）。

1.2 试剂和样品

快速糖分析试剂盒（Sciex公司），内含电泳缓冲液、变性试剂、酶解缓冲液、磁珠悬浮液、APTS标记物、内标物DP2、荧光内标物（DP3，DP15混合）、磁力架。未涂层熔融石英毛细管（50 µm内径，Sciex公司）；N-糖苷酶-F（PNGase F，New England公司，乙腈（HPLC级，Merck公司），1 mol·L^-1氰基硼氢化钠（NaBH₃CN），溶剂为四氢呋喃（THF，Sigma-Aldrich公司），0.1 mol·L^-1氢氧化钠溶液和0.1 mol·L^-1盐酸（Sciex公司）。去离子水（Milli-Q Labsystem，Millipore公司）。欧洲rhEPO理化参考品购自欧洲药品质量管理局（EDQM），本研究用EPO样品来自3家不同企业，均为科室留样。

2 方法与结果 2.1 样品的处理

取3批不同厂家的样品各400 μL，分别置于超滤管（截留分子量10 kD）中，14 000 r·min^-1离心10 min，弃去滤过的下层溶液；在超滤管中再加入超纯水300 μL，14 000 r·min^-1离心10 min。收集超滤管中的上层液体，用超纯水调整体积为100 μL的3批样品记为样品E₁、E₂、E₃，按紫外分光光度法^[14]测定E₁、E₂、E₃质量浓度分别为7、6.8、6.4 mg·mL^-1。取欧洲rhuEPO理化参考品，同法制备，用超纯水调整质量浓度为5 mg·mL^-1，记为样品E₀。取200 μL磁珠悬浮液，分别和10 μL样品E₁、E₂、E₃、E₀于1.5 mL离心管管中进行混合；金属浴预热1 min后加入快速糖分析试剂盒中的变性试剂5 μL，于60 ℃反应8 min；再加入PNGase F酶解液[酶解缓冲液-PNGase F酶（6:1）]12 μL，于60 ℃金属浴反应20 min；取出后快速涡旋10 s，加入200 μL乙腈用于寡糖的捕获；再次快速涡旋10 s后静置1 min以使得寡糖与磁珠充分结合；置于试剂盒提供的磁力架上，磁珠紧贴于离心管底部，最后小心移除上层溶液后加入10 μL快速糖分析试剂盒中的APTS荧光标记溶液[APTS标记物-酶解缓冲液-1 mol·L^-1 NaBH₃CN-内标物DP2（9:3:1:1）]，快速涡旋后于60 ℃金属浴反应20 min，取出后，加入乙腈清洗磁珠200 μL，置于试剂盒提供的磁力架上，磁珠紧贴于离心管底部，小心吸除上清，如此反复清洗3遍，以去除过量的标记试剂，最终加入100 μL超纯水洗脱磁珠上捕获的糖链，在磁力架上小心吸取上清，待进样分析。

2.2 rhEPO的N-寡糖毛细管电泳快速分离分析

在毛细管卡盒中安装总长度为30 cm的毛细管，有效长度为20 cm，毛细管分离温度设为25 ℃，样品储存温度设为10 ℃；电迁移进样，电压设为-2 kV，先进样处理好的样品2 s再进样荧光内标物2 s；毛细管分离电压为-30 kV，分离时间5.5 min；检测器为LIF，激发波长及发射波长分别为488 nm和520 nm；分离结束后依靠GU Value软件数据库实时的进行糖型鉴定。样品E₀、E₁、E₂、E₃的CE-LIF电泳叠加图谱见图 1。图 2为E₀的CE-LIF的电泳图谱，共鉴定出7种糖型，分别为FA2G2S2、FA2BG2S2、A2（6）G1S1、FA2（3）G1S1、A2G2S1、A2B、M7；S1、S2分别表示有1个和2个唾液酸连接在半乳糖上，电泳谱图中的峰1、峰2和峰3均为含有复杂结构唾液酸的糖型，且具有1个核心岩藻糖；A2B则表示样品均含有平分型N-乙酰葡糖胺类。基于上述糖型的鉴定和校准峰面积的积分，对不同rhEPO样品的糖型和含量差异进行了比较，比较结果参见图 3。

2.3 精密度试验

以样品E₀为例，对方法的重复性进行了考察，连续5针进样分离的电泳图如图 4所示。经计算，FA2BG2S2、FA2（3）G1S1和A2B 3个峰的迁移时间的RSD均小于0.2%，校正峰面积百分比的RSD均小于2.6%，精密度良好。

2.4 稳定性试验

以样品E₀为例，对方法的稳定性进行考察。取样品E₀的供试溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h进样分离，结果见表 1所示。经计算，FA2BG2S2、FA2（3）G1S1和A2B 3个峰的迁移时间的RSD均不高于0.44%，校正峰面积百分比的RSD均不高于5.7%，稳定性良好。

3 讨论

糖基化是一种重要的翻译后修饰，糖基化对蛋白质的体内半衰期，免疫原性等有重要的影响。rhEPO作为一种高度糖基化的重组蛋白药物，对糖基化的质量控制尤为重要。在本研究中，采用CE-LIF方法对rhEPO的N-糖寡糖进行了快速分析，由于O-寡糖目前不易酶切，且含量不高，此次研究未涉及。结合磁珠辅助对糖链进行酶切和标记，使得前处理过程缩短到60 min；在优化的CE分离条件下，可在5 min内完成分离，是目前报道的rhuEPO寡糖分析的最快的方法。并可使用数据库进行实时的糖型鉴定。结果显示该方法精密度良好（迁移时间RSD小于0.2%，校正峰面积百分比RSD小于2.6%），该法可对不同厂家生产的rhEPO样品中N-寡糖进行定性和定量分析。

糖型数据库分析是基于系统GU糖型数据库，GU是葡萄糖单位，通过将不同的寡糖赋予GU值，通过DP2，DP3，DP15三内标的相对迁移时间和寡糖的迁移时间来计算识别^[15]，基于CE方法已有的GU数据库可以鉴定76种糖型主要覆盖人IgG糖型。rhEPO是一种复杂的高度唾液酸化的糖蛋白，根据目前的GU数据库分析所得的rhEPO的糖型鉴定结果仅作为参考。在CE方法尚无法有效与质谱技术联用的前提下，rhEPO糖型的准确鉴定还依赖于专门数据库的建立。但糖型的鉴定准确与否并不影响rhEPO的寡糖图谱的绘制和差异性检测。

从rhEPO的寡糖分析结果来看，不同的企业的N-寡糖图谱具有差异，这主要和生产工艺相关，不同的生产条件如工作细胞、培养方式、培养基配方等等的不同会引起不同的糖基化^[16]，表现为不同的寡糖图谱，形成各企业产品特有的质量表征。在寡糖类型上，各个样品均含有FA2BG2S2、A2（6）G1S1、FA2（3）G1S1、A2B这4个相对高丰度的糖型差异主要体现在FA2B、FA2（6）G1、M7、M8和A2（3）G1这5个微量的寡糖上，样品E₁和E₂含有M7和M8，而样品E₃和E₀则未检出该2种糖型。

利用CE-LIF强大的分离能力，可以有效对rhEPO的N-寡糖实现快速分离分析，实现在rhEPO生产过程及质量控制中糖基化监控，对保证生产工艺的稳定性及产品质量的稳定具有积极意义。