2019, Vol. 39 
2. 上海中科新生命生物科技有限公司, 上海 200233
2. Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd, Shanghai 200233, China
人乳头瘤病毒（HPV）疫苗可以预防相应型别的HPV感染，从而可以预防HPV感染引起的一系列相关疾病，如尖锐湿疣、宫颈癌、直肠癌、口腔癌等。目前国内已有的HPV预防性疫苗仅有二价HPV疫苗、四价HPV疫苗和九价HPV疫苗各1种，且均为进口疫苗，我国虽然也有10余个企业研发了20多个HPV疫苗，但还均处在申请临床前或者临床研究阶段。HPV基因组包括6个早期基因（E1，E2，E4~E7）和2个晚期基因（L1，L2），其中E6和E7为HPV主要的致癌基因，L1的编码产物为主要衣壳蛋白，是疫苗的保护性抗原[1]，对相同基因型病毒感染存在较高的保护效果，在不同基因型之间也存在一定的交叉保护效果[2]，L1蛋白的氨基酸的改变可能影响其感染效率或者病毒抗原性[3]，相同型别的L1蛋白抗原性相同，同型L1抗原氨基酸序列同源性高达90%[4]。采用HPV型特异的单抗，建立的ELISA方法，可以鉴别不同型别的L1抗原[5-6]，质谱分析方法是目前对蛋白质结构研究的一种常用技术，在蛋白鉴别中发挥重要作用[7]，已有报道建立质谱分析的方法对HPV疫苗的L1抗原进行定性和定量分析[8]。
肽图分析是评价重组产品蛋白质一级结构及其生产工艺稳定性的重要方法，同时也是考察产品批间一致性及其工程菌遗传稳定性的重要手段，是重组蛋白类生物技术产品必不可少的重要检测项目。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版中收录了2种重组蛋白生物制品的肽图检查法，即胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法和溴化氰裂解法[9-10]。本研究使用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法，对不同企业L1抗原进行肽图分析，能够有效评价HPV疫苗的批间一致性，同时发现了18型L1抗原肽图存在显著的特征峰。利用质谱分析的方法，证明了是由于不同企业之间的L1抗原氨基酸序列的个别位点差异导致的肽图特征峰。本研究建立的18型L1抗原肽图特征峰分析方法可应用于HPV18型L1抗原的鉴别和批间一致性质量控制。
1 仪器和材料 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent ZORBAX 300 SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Shimadzu LC-30AD高效液相色谱仪，Thermo Acclaim PepMap 100 Nano-Trap柱（75 μm×2 cm，nanoViper 2Pk C18，3 μm，100 Å），Thermo Acclaim PepMap RSLC分析柱（50 μm×15 cm，nanoViper 2Pk C18，3 μm，100 Å）；Thermo Q-Exactive质谱仪；Eppendorf台式高速冷冻离心机。
1.2 材料HPV18型L1抗原由上海博唯生物科技有限公司、江苏瑞科生物技术有限公司、上海生物制品研究所有限责任公司、北京康乐卫士生物技术股份有限公司、厦门万泰沧海生物技术有限公司提供，编号为A~E；胰蛋白酶（TPCK处理，货号V5111），Promega试剂公司；甲酸、乙腈为色谱纯；碳酸氢铵为分析纯；Millipore超纯水；超滤离心管（截流量10kD），Millipore公司。
1.3 溶液配制1%碳酸氢铵溶液：称量碳酸氢铵1 g，加超纯水溶解并稀释至100 mL，混匀；0.5 mg·mL-1胰蛋白酶：取胰蛋白酶干粉20 μg（1瓶），加入包装内自带重悬缓冲液溶液40 μL使充分溶解。
2 方法 2.1 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法肽图分析 2.1.1 HPLC色谱条件以0.1%三氟乙酸-水为流动相A，0.1%三氟乙酸-乙腈为流动相B，色谱柱以100%的流动相A平衡，梯度洗脱（0~10 min，100%A；10~80 min，100%A→30%A；80~91 min，30%A→100%A），流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长214 nm，进样量100 μL。
2.1.2 样品处理取HPV18型L1抗原样品适量，根据样品蛋白浓度，用1%碳酸氢铵溶液稀释或用10 kD超滤离心管浓缩至0.8 mg·mL-1，取0.5 mL加至0.5 mL超滤离心管中，10 000 r·min-1超滤离心30 min至体积小于50 μL，重复操作4次后，补加1%碳酸氢铵溶液至0.5 mL，按照酶与蛋白1:50（w/w）加入胰蛋白酶（0.5 mg·mL-1）16 μL，使用移液器剧烈吹打几次，使胰蛋白酶与沉淀的蛋白样品充分接触，封口膜封好超滤离心管，37 ℃水浴21 h，待酶切完毕，取出超滤管10 000 r·min-1直接超滤离心10 min，取滤液，使用Agilent 1260高效液相色谱仪分离肽段，得到HPV18型L1抗原肽图，比较不同公司样品的肽图，采用掐尖方式收集差异特征峰半峰宽肽段。
2.1.3 方法重复性平行处理6份A公司HPV18型L1抗原，分别按上述色谱条件进样分析，计算特征峰保留时间的RSD（B~E公司样品与A公司做同样处理），考察试验方法的重复性。
2.1.4 疫苗批间一致性取A~E公司各3批次HPV18型L1抗原，按上述方法平行酶切处理，按上述色谱条件进样，记录色谱图，计算主要峰的保留时间的RSD，评价疫苗的批间一致性。
2.2 质谱鉴定特征峰对“2.1.2”项中收集的差异特征峰，利用UPLC-MS/MS进行质谱序列分析。UPLC色谱条件：以水溶液（含0.1%甲酸）为流动相A，84%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）为流动相B，色谱柱以5%的流动相B平衡，梯度洗脱（0~20 min，5%B→35%B；20~22 min，35%B→100%B；22~30 min，100%B），流速250 nL·min-1，柱温为常温，进样量5 μL。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正离子全扫描检测模式，喷雾电压2 kV，毛细管温度300 ℃。根据各差异特征峰的质谱数据及其碎片离子，确定差异特征峰的氨基酸序列。
2.3 氨基酸序列比较分析采用DNAStar软件的Megalign程序分析不同公司样品的理论氨基酸序列，比较氨基酸差异，结合质谱对特征峰的氨基酸序列差异进行对比，验证和确定肽图特征峰的氨基酸序列。
3 结果 3.1 液相色谱肽图重复性对A公司的HPV18型L1抗原进行6次平行分析，结果各共有峰保留时间的RSD最大值为0.32%，B~E公司各共有峰保留时间的RSD最大值分别为0.49%、0.25%、0.31%、0.24%，均小于1%，表明本方法重复性良好，符合色谱特征图谱研究的要求。
3.2 批间一致性A~E公司各3批次HPV18型L1抗原肽图比较见图 1，每个公司产品的肽图主要峰的保留时间基本一致，A~E公司产品主要肽图峰保留时间的最大RSD分别为0.35%、0.74%、0.23%、0.51%、0.20%，说明各批次样品之间批间一致性较好（图 1）。
|
图 1 A~E公司各3个批次的HPV18型L1抗原肽图批间一致性比较 Fig.1 Comparison of peptide maps among three batches of HPV18 L1 antigen from companies A-E |
利用Megalign软件分析不同公司样品的L1蛋白氨基酸序列同源性，同源性为92.9%。5个公司氨基酸序列差别如下：D公司相对A、B、C公司，N端缺失MALWR（1~5号氨基酸）；E公司相对A、B、C公司，N端缺失ALW（2~4号氨基酸）；B、D公司相对A、C、E公司，T变为N（88号氨基酸）；E公司相对A、B、C、D公司，T变为A（428号氨基酸）；E公司相对A、B、C公司，S变为A（494号氨基酸）；D公司相对A、B、C、E公司，C端缺失部分氨基酸。比较结果见图 2。
|
图 2 Megalign软件比较氨基酸序列 Fig.2 Amino acid sequence alignment with Megalign |
不同公司的肽图特征峰见图 3，图中可见编号为1~6的6个差异特征峰，不同公司样品的保留时间略有不同，现以B、E公司做为代表说明，分别为：1号峰（19.428±0.115）min（B），2号峰（37.186±0.042）min（B），3号峰（38.058±0.046）min（B），4号峰（20.428± 0.042）min（E），5号峰（22.208±0.018）min（E），6号峰（26.373±0.030）min（B）。
|
图 3 A~E公司HPV18型L1抗原样品HPLC色谱肽图 Fig.3 HPLC peptide maps of HPV18 L1 antigen sample from companies A-E |
对比收集了1~6号差异特征峰的肽段，按“2.2”项方法进行质谱定性，测其最高丰度，结果见表 1。5号峰为4号特征峰酶切不完全出现的特征峰，仅出现在E公司样品。6号峰为非特异峰，仅未出现在D公司样品。
|
表 1 差异特征峰肽段主要成分鉴定结果 Tab.1 Identification of main components of differential characteristic peak peptides |
1、4和5号特征峰结构分析：图 3中显示D、E公司相对于A、B、C公司1号峰缺失，对收集的A、B、C公司样品的1号特征峰肽段进行质谱分析，测其最高丰度，证明其主要成分氨基酸序列均为SAPSATTSSK（见表 2），对应的图 2中所示D公司样品缺失487~496这段序列，1号特征峰缺失；图 3中E公司样品肽图 1号特征峰缺失的同时出现了4号峰，对应分析图 2，这可能是由于E公司样品的494位S转变为A，使得487~496位序列转变为SAPSATTASK导致，这一推断与4号和5号特征峰质谱结果一致（见表 2）。
|
|
表 2 特征峰主要成分质谱分析结果 Tab.2 Mass spectrometric analysis of main components of characteristic peaks |
2、3号特征峰结构分析：由表 3见，A、C、E公司相对于B、D公司的样品，2号特征峰有明显的缺失，而B、D公司相对于A、C、E公司的样品，3号特征峰也明显变小。比对分析5家公司氨基酸理论序列，总结共性发现A、C、E公司的样品，88位为T，而B、D公司的样品，88位为N，推测2、3号特征峰的差异可能是由于88位氨基酸的改变导致。对B、D公司样品的2、3号特征峰进行质谱分析，结果表明2号特征峰最高丰度氨基酸序列为FGLPDNSIYNPETQR（见表 2），3号特征峰最高丰度氨基酸序列为YPDYLQM；对A、C、E公司的样品进行质谱分析，结果表明3号特征峰最高丰度氨基酸序列为FGLPDTSIYNPETQR和YPDYLQM（见表 2）。综上，当88位N转变成T时，会导致2号特征峰会缺失的同时3号特征峰响应值会增强。
|
|
表 3 不同公司HPLC肽图差异特征峰 Tab.3 Characteristic peaks of HPLC peptide maps from different companies |
肽图分析是通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性，是蛋白和多肽类药物研究中极为有用的一项技术[11-13]。现在最常用鉴定蛋白质一级结构的方法依托的是高效液相色谱-质谱联用技术，该方法准确度高，可以分析氨基酸修饰[14]，如糖基化[15-16]。但质谱检测成本和技术要求较高，并未常规用于肽图分析。
本文采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法，对多公司生产的不同氨基酸序列的HPV18型L1抗原肽图进行对比分析。在《中国药典》2015年版三部附录—肽图检查法的基础上，对酶解条件[17]、洗脱梯度和脱盐浓缩过程进行优化，得到的肽图色谱峰分离度良好，批间一致性好，几种不同氨基酸序列的HPV18型L1抗原肽图存在显著的差异，可采用本法进行HPV18型L1抗原的批间一致性质量控制。
同时，本研究还采用质谱手段证实了HPV18型L1抗原肽图的特征峰是由于氨基酸序列不同导致的，6个肽图特征峰中质谱鉴别出1~5号特征峰，其中E公司的样品出现了4号和5号特征峰，可能是由于肽段酶切不完全导致的，试验采用延长酶切时间和增加酶量，4号和5号特征峰仍然同时出现，这可能是疫苗生产工艺导致的L1抗原肽链折叠、卷曲的程度不同，导致酶切不完全，为了保证不同公司样品的可比性，本研究统一采用了酶和蛋白比例1:50，酶切21 h进行样品的酶解处理。D公司样品未出现6号特征峰，但质谱未分析出6号特征峰含有特异性的肽段，是多种肽段的混合。E公司相对A、B、C、D公司的样品，428号氨基酸T变为A，在E公司样品的肽图中未能定位出其特征峰。以上结果提示：在酶切和液相色谱条件固定的情况下，由于肽段酶切不完全产生的峰可能成为肽图的特征峰，一些非特异酶切产生的肽段也可成为特征峰；而且，氨基酸序列的不同，也不一定全部反应在肽图特征峰中。
总之，本研究建立的高效液相色谱-质谱联用技术可以鉴别不同公司HPV18型L1抗原，也证明了肽图分析可以评价和监测疫苗的批间一致性，发现菌毒种、生产工艺等改变引起的氨基酸改变；肽图分析还可以对不同氨基酸序列的疫苗进行鉴别，应该充分认识肽图在重组蛋白疫苗原液质量控制中的作用。目前，国内有10多个公司在研发HPV多价疫苗，已经批准的有2价、4价和9价疫苗，本研究仅是对共有型别18型L1抗原进行了肽图分析和特征峰的鉴别，展示出肽图分析是HPV疫苗原液中必不可少的检测项目的重要意义，有必要对其他型别的HPV疫苗肽图进行特征性分析，探讨建立型特异的肽图鉴别方法，以及不同来源的同型L1抗原的肽图指纹图谱鉴别分析方法。
致谢: 上海博唯生物科技有限公司、江苏瑞科生物技术有限公司、上海生物制品研究所有限责任公司、北京康乐卫士生物技术股份有限公司、厦门万泰沧海生物技术有限公司为本研究提供了L1抗原。
| [1] |
HUH WK, JOURA EA, GIULIANO AR, et al. Final efficacy, immunogenicity, and safety analyses of a nine-valent human papillomavirus vaccine in women aged 16-26 years:a randomised, double-blind trial[J]. Lancet, 2017, 390(10108): 2143. DOI:10.1016/S0140-6736(17)31821-4 |
| [2] |
WOESTENBERG PJ, KING AJ, van BENTHEM BHB, et al. Bivalent vaccine effectiveness against type-Specific HPV positivity:evidence for cross-protection against oncogenic types among Dutch STI clinic visitors[J]. J Infect Dis, 2018, 217(2): 213. DOI:10.1093/infdis/jix582 |
| [3] |
NING T, WOLFE A, NIE J, et al. Naturally occurring single amino acid substitution in the L1 major capsid protein of human papillomavirus type 16:alteration of susceptibility to antibody-mediated neutralization[J]. J Infect Dis, 2017, 216(7): 867. DOI:10.1093/infdis/jix274 |
| [4] |
SANG BC, BARBOSA MS. Single amino acid substitutions in "low-risk" human papillomavirus(HPV)type 6 E7 protein enhance features characteristic of the "high-risk" HPV E7 oncoproteins[J]. Proc Natl Acad Sci, 1992, 89(17): 8063. DOI:10.1073/pnas.89.17.8063 |
| [5] |
FRATI E, BIANCHI S, COLZANI D, et al. Genetic variability in the major capsid L1 protein of human papillomavirus type 16(HPV-16)and 18(HPV-18)[J]. Infect Genet Evol, 2011, 11(8): 2119. DOI:10.1016/j.meegid.2011.06.014 |
| [6] |
TINELLI A, LEO G, DELL'EDERA D, et al. Molecular methods for a correct diagnosis of multiple HPV infections and clinical implications for vaccine[J]. Int J Gynecol Cancer, 2011, 21(3): 545. DOI:10.1097/IGC.0b013e31820f5eed |
| [7] |
RATHORE D, FAUSTINO A, SCHIEL J, et al. The role of mass spectrometry in the characterization of biologic protein products[J]. Expert Rev Proteomics, 2018, 15(5): 431. DOI:10.1080/14789450.2018.1469982 |
| [8] |
ZHU L, YIN L, XUE J, et al. Mass spectrometry genotyping of human papillomavirus based on high-efficiency selective enrichment of nanoparticles[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2018, 10(48): 41178. DOI:10.1021/acsami.8b16694 |
| [9] |
中华人民共和国药典2015年版.三部[S].2015: 附录Ⅷ E ChP 2015.Vol Ⅲ[S].2015: Appendix Ⅷ E |
| [10] |
饶春明, 张翊, 韩春梅, 等. 重组人白细胞介素-11的胰蛋白酶切肽图分析[J]. 药学学报, 2000, 35(5): 378. RAO CM, ZHANG Y, HAN CM, et al. Peptide mapping analysis of recombinant human interleukin-11 by trypsin digestion[J]. Acta Pharm Sin, 2000, 35(5): 378. DOI:10.3321/j.issn:0513-4870.2000.05.014 |
| [11] |
迟祥, 李铮, 贾媛, 等. 重组戊型肝炎疫苗抗原P179表征分析[J]. 中国生物制品学杂志, 2016, 29(11): 1126. CHI X, LI Z, JIA Y, et al. Characterization analysis of recombinant hepatitis E vaccine antigen P179[J]. Chin J Biol, 2016, 29(11): 1126. |
| [12] |
杨英, 饶春明, 王威, 等. 液质联用分析重组人白细胞介素-11的肽图[J]. 药学学报, 2006, 41(8): 756. YANG Y, RAO CM, WANG W, et al. Peptide mapping analysis of recombinant human interleukin-11 with HPLC-ESI-Q-TOF/MS spectrometry[J]. Acta Pharm Sin, 2006, 41(8): 756. DOI:10.3321/j.issn:0513-4870.2006.08.014 |
| [13] |
曾文珊, 廖海明, 杨仲元, 等. 肽图分析在重组人甲状旁腺素1-34产品质量拉制中的应用[J]. 中国药学杂志, 2006, 41(4): 1020. ZENG WS, LIAO HM, YANG ZY, et al. Significance of peptide mapping in the quality control of recombinant human parathyroid hormone 1-34 products[J]. Chin Pharm J, 2006, 41(13): 1020. DOI:10.3321/j.issn:1001-2494.2006.13.018 |
| [14] |
李晶, 何辉, 程速远, 等. 液相肽图法推断聚乙二醇化重组人生长激素的聚乙二醇修饰位点研究[J]. 中国药学杂志, 2012, 47(8): 626. LI J, HE H, CHENG SY, et al. RP-HPLC peptide mapping to determine pegylation sites of PEG-rhGH[J]. Chin Pharm J, 2012, 47(8): 626. |
| [15] |
李凤, 张艳梅, 何金娇, 等. 液相色谱-串联质谱法分析新红细胞生成刺激蛋白的肽质量指纹图谱和糖肽结构[J]. 中国医药工业杂志, 2018, 49(6): 803. LI F, ZHANG YM, HE JJ, et al. Primary structure elucidation and glycopeptides identification of novel erythropoiesis stimulating protein by LC-MS/MS[J]. Chin J Pharm, 2018, 49(6): 803. |
| [16] |
陶磊, 刘周阳, 韩春梅, 等. 液质联用对重组胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白中的制品相关蛋白进行定性定量分析[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(11): 1899. TAO L, LIU ZY, HAN CM, et al. Identification and quantification of the product-related proteins in recombinant GLP-1-Fc fusion protein using UPLC-MS[J]. Chin J Pharm Anal, 2018, 38(11): 1899. |
| [17] |
王绿音, 杨慧敏, 李晶, 等. 甘精胰岛素肽图分析方法研究[J]. 生物技术通讯, 2018, 29(5): 667. WANG LY, YANG HM, LI J, et al. Research of peptide peptide mapping method for insulin glargine[J]. Lett Biotechnol, 2018, 29(5): 667. DOI:10.3969/j.issn.1009-0002.2018.05.015 |