2019, Vol. 39 
乳香、没药为临床上常用的药对，乳香辛温香窜，善透窍以理气，能于血中行气，舒筋活络，消肿止痛，以行气活血为主；没药味辛性温，擅化瘀理血，消肿痛，以活血散瘀为主[1]。两药相须配伍使用具有活血化瘀、消肿生肌止痛的作用。二者配伍使用最早出自《证治准绳》之“乳香止痛散”。《本草纲目》记载：“乳香活血、没药散血，皆能止痛消肿生肌，故二药每每相兼而用。”药对是方剂组成的核心，其化学成分复杂，方剂中药对功效的不同体现在配伍比例的不同。通过前期对南京中医药大学方剂文献数据库中所有含有乳香、没药的方剂（共2 236首）进行统计分析，统计出乳香-没药的配伍比例有50种，其中1:1、2:1、1:2、2:3、3:2、3:4及5:3共7个比例出现频次较高，而乳香-没药不同比例配伍的化学成分分析还未见报道。故本实验在前期研究基础上[2-7]，采用UPLC-TQ/MS联用技术，对乳香-没药7个不同配伍比例（1:1，2:1，1:2，2:3，3:2，3:4，5:3）中化学成分溶出变化进行定量分析，从化学成分的角度揭示乳香-没药不同比例配伍其化学成分的溶出变化，以期为该药对配伍功效物质基础、量效关系以及临床合理用药提供科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters ACQΜITY UPLC系统（包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；Waters公司）；Xevo质谱检测器（Waters公司）；MassLynx 4.1质谱工作站软件（Waters公司）；EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Anke GL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；BT125型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.2 试剂超纯水经易普易达超纯水制备系统自制；乙腈（默克公司）为色谱纯，乙醇、甲醇等化学试剂（南京良纬生物科技有限公司）均为分析纯。
1.3 药品乳香（批号171010）、没药（批号171108）均产自广西，购自苏州市天灵中药饮片公司。炮制方法均为醋制，经南京中医药大学段金廒教授鉴定，乳香本品为橄榄科植物乳香树Boswellia carterii Birdw.树皮渗出的树脂；没药为橄榄科植物地丁树Commiphora myrrha Engl.的干燥树脂。
乳香对照品：3α-乙酰甘遂-7，24-二烯-21-酸（批号15698198，纯度≥98%）、乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸（批号15687198，纯度≥98%）、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸（批号18032706，纯度≥98%）、3-α羟基甘燧烷-7，24-二烯-21-酸（批号15695198，纯度≥98%）、11-酮基乳香酸（批号18032113，纯度≥98%）均购自南京良纬生物科技有限公司，3-羟基甘遂烷-8，24-二烯-21-酸（批号20150520，纯度≥95%）、3-O-乙酰基-α乳香酸（批号20150515，纯度≥98%）均购自宝鸡辰光生物科技有限公司，3-乙酰基氧基甘遂-8，24-二烯-21-羧酸（纯度≥95%）为实验室自制，β-乳香酸（批号20150504，纯度≥98%）、α-乳香酸（批号20150522，纯度≥95%）、3β-乙酰氧基-5α-8，24-羊毛脂二烯-21-酸（批号20150527，纯度≥98%）、3α-乙酰氧基-羊毛脂-8，24-二烯-21-酸（批号20150519，纯度≥98%）均购自宝鸡辰光生物科技有限公司。
没药对照品：2-甲氧基-8，12-环氧吉马烷-1（10）7，11-三烯-6-酮（纯度≥95%）为实验室自制，去氢松香酸（批号18032605，纯度≥98%）及松香酸（批号18011502，纯度≥98%）购自良纬生物科技有限公司，2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉马烷-1（10）-烯-6-酮（纯度≥95%）为实验室自制。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 供试品溶液取醋制乳香、醋制没药适量，粉碎，过40目筛，各精密称取乳香-没药7种配伍比例[1:1（10.118 5 g:10.040 5 g）、2:1（13.389 0 g: 6.719 9 g）、1:2（6.786 9 g:13.239 1 g）、2:3（8.016 0 g:12.084 1 g）、3:2（12.136 0 g:8.108 1 g）、5:3（12.545 1 g:7.596 0 g）、3:4（8.666 9 g:11.485 1 g）]的粉末约20 g，分别置于500 mL圆底烧瓶中，用80%乙醇水回流提取2次，每次以12倍量体积提取，每次提取3 h后过滤，合并2次滤液，减压浓缩至0.5 g·mL-1，置蒸发皿上将有机溶剂与水烘干，即得乳香-没药不同比例配伍的提取物干浸膏，称量。将制得的干浸膏转移至离心管中，称量后，4 ℃冷冻保存待用。
取各配伍比例的乳香-没药的提取物干浸膏[1:1配伍的100 mg，2:1配伍的102 mg，1:2配伍的100 mg，2:3配伍的100 mg，3:2配伍的101 mg，3:4配伍的104 mg，5:3配伍的102 mg]，分别置于10 mL量瓶中，加入80%甲醇水9 mL，超声（500 W，40 kHz）1 h，溶解后，取出放冷，加80%甲醇水定容至刻度，摇匀，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.1.2 混合对照品溶液精密称定乳香、没药的对照品各1 mg，用80%甲醇水配制成1 mg·mL-1的单一对照品溶液；分别取一定量的单一对照品溶液于10 mL量瓶中，用80%甲醇水定容至刻度，制成混合对照品溶液（其中含2-甲氧基-8，12-环氧吉马烷-1（10），7，11-三烯-6-酮45.6 μg·mL-1，3α-乙酰甘遂-7，24-二烯-21-酸34.0 μg·mL-1，3-羟基甘遂烷-8，24-二烯-21-酸40.8 μg·mL-1，乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸36.5 μg·mL-1，3-O-乙酰基-α乳香酸53.2 μg·mL-1，3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸47.2 μg·mL-1，3-乙酰基氧基甘遂-8，24-二烯- 21-羧酸34.0 μg·mL-1，β-乳香酸50.4 μg·mL-1，α-乳香酸41.2 μg·mL-1，去氢松香酸43.6μg·mL-1，松香酸45.6 μg·mL-1，3-α羟基甘燧烷-7，24-二烯-21-酸38.8 μg·mL-1，2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉马烷-1（10）-烯-6-酮45.2 μg·mL-1，11-酮基乳香酸41.6 μg·mL-1，3β-乙酰氧基-5α-8，24-羊毛脂二烯-21-酸25.9 μg·mL-1，3α-乙酰氧基-羊毛脂-8，24-二烯-21-酸44.0 μg·mL-1）。
2.2 UPLC-TQ/MS分析条件 2.2.1 色谱条件采用AcquityTM UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱温30 ℃，流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0~1 min，90%A；1~8 min，95%A；8~9 min，95%A；9~10 min：90%A），流速0.3 mL·min-1，进样量2 μL。
2.2.2 质谱条件采用电喷雾正、负离子源（ESI+/ESI−），多反应检测（MRM方式），氦气流速35 arb，辅助气流速15 arb，毛细管温度275 ℃，喷雾电压3.5 kV，管透镜电压水平65%，毛细管电压35 V，扫描范围m/z 100~1 000；质量分辨率60 000。二级质谱分析：裂解模式为高能诱导解离（HCD），隔离宽度为2.0 Da，归一化碰撞能量35 V，激活时间30 ms，碰撞气为高纯氮气。主要质谱检测参数见表 1，混合对照品及样品离子流色谱图见图 1、2。
|
表 1 16个化合物主要质谱检测参数 Tab.1 MS parameters of 16 investigated compounds |
|
图 1 混合对照品溶液总离子流色谱图 Fig.1 Total ion chromatograms of mixed reference substances |
|
图 2 供试品溶液总离子流色谱图 Fig.2 Total ion chromatograms of sample solution |
取混合对照品溶液，用80%甲醇水分别稀释2、10、20、100、200、1 000倍，经0.22 μm微孔滤膜过滤，依次进样分析，以峰面积Y为纵坐标，对照品的浓度X为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 2。
|
|
表 2 回归方程、r值及线性范围 Tab.2 Regression equation, r value and linear range |
取混合对照品溶液，连续进样6次，记录各化合物色谱峰。结果见表 3，各主要色谱峰峰面积的RSD均小于6.0%，表明仪器精密度良好。
|
|
表 3 各化合物的精密度、稳定性、重复性及回收率试验结果 Tab.3 The results of precision, stability, repeatability and recovery tests of the 16 analytes |
按“2.1.1”项下方法，平行制备6份乳香-没药以1:1配伍的供试品溶液，依次进样测定，记录样品中各待测物色谱峰峰面积，计算含量。结果见表 3，各含量的RSD均小于5.7%，表明方法重复性良好。
2.4.3 稳定性试验取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定，记录各标准品色谱峰。结果见表 3，各含量的RSD均小于5.98%，表明供试品溶液在10 h内化学性质稳定。
2.4.4 加样回收率试验取“2.1.1”项下乳香-没药以1:1配伍的样品6份，精密加入与样品中各待测化合物等量的对照品，按“2.1.1”项下方法制备供试溶液，进样测定并计算各对照品的回收率。结果见表 3，各指标成分的平均加样回收率为84.5%~104.9%，RSD为1.4%~4.8%。
2.5 乳香-没药7种配伍比例分析结果取提取物浓缩液置蒸发皿上将有机溶剂与水烘干，即得提取物干浸膏，干浸膏得率=干浸膏量/生药量×100%。乳香-没药7种不同配伍比例干浸膏得率及16种化学成分含量测定结果见表 4和表 5。
|
|
表 4 乳香-没药7种配伍比例中成分总含量及浸膏得率 Tab.4 Total content and extraction yield of 7 kinds of compatibility ratios of frankincense-myrrha |
|
|
表 5 乳香-没药不同配伍比例中16个化学成分含量（%） Tab.5 The contents of 16 chemical components in different compatibility ratios of frankincense-myrrha |
结果表明乳香-没药为2:1配伍的16个化学成分总含量最高且浸膏得率较高；16个化合物中，3α-乙酰甘遂-7，24-二烯-21-酸、乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸、β-乳香酸、3β-乙酰氧基- 5α-8，24-羊毛脂二烯-21-酸、3α-乙酰氧基-羊毛脂-8，24-二烯-21-酸在乳香-没药比例为1:1配伍时含量最高；3-羟基甘遂烷-8，24-二烯-21-酸、3-乙酰基氧基甘遂-8，24-二烯-21-羧酸、松香酸、3-α羟基甘燧烷-7，24-二烯-21-酸在乳香-没药比例为2:1配伍时含量最高；3-O-乙酰基-α乳香酸在乳香-没药比例为3:2配伍时含量最高；2-甲氧基-8，12-环氧吉马烷-1（10），7，11-三烯-6-酮、3-乙酰基-11-酮基-β-乳香酸、2-甲氧基-5-乙酰基-呋喃吉马烷-1（10）-烯-6-酮在乳香-没药比例为3:4配伍时含量最高；α-乳香酸、11-酮基乳香酸在乳香-没药比例为5:3配伍时含量最高。其中，乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸仅在配伍比例为1:1配伍时检测到，16个化合物在乳香-没药1:1配伍时全部检测出。
3 讨论药对是中医临床常用的配伍形式，是历代医家长期医疗实践的经验总结，既是方剂配伍的精华与核心所在，也是辨证施治针对性与治疗性的明确体现[8]。方剂药味量、君药量、各药物间的用量比例变化，不仅可改变方剂药力的大小，而且能改变方剂的功用主治[9]。如《太平圣惠方·治水泻诸方》中茱萸圆方，有黄连-吴茱萸以1:1配伍，用于下痢水泻；《丹溪心法》中有黄连-吴茱萸按6:1组成左金丸，用于清肝泻火；而黄连-吴茱萸为1:6配伍，用于肝寒犯胃，偏胃寒甚者。方剂的主证功效不仅与药味有关，而且依赖于药量，药量的变化会使方剂发生量变，以至质变[10-11]。研究不同配比功效物质的溶出变化特点，既可为阐明中药有效成分随配伍比例变化的内在规律，为指导临床合理用药和提升方剂疗效提供依据[12]。
本实验采用UPLC-TQ/MS联用技术分析乳香-没药7种配伍比例中的16个化学成分溶出变化，其优越的分离性能与质谱高选择性、高灵敏度的特性结合起来，具有分离能力强，时间短，定量分析结果可靠的优点。乳香、没药多为萜类成分，极性较小，且母核结构多类似，故利用UPLC-TQ/MS联用技术可以快速有效地对乳香-没药7种配伍比例中的16个化学成分进行定量分析。
结果发现，乳香-没药为2:1配伍的16个化学成分总含量最高且浸膏得率较高；16个化合物中，有5个化合物在乳香-没药比例为1:1配伍时含量最高；4个化合物在乳香-没药比例为2:1配伍时含量最高；1个化合物在乳香-没药比例为3:2配伍时含量最高；3个化合物在乳香-没药比例为3:4配伍时含量最高；2个化合物在乳香-没药比例为5:3配伍时含量最高；去氢松香酸在乳香-没药7种比例配伍中含量均较低。其中，乙酰11α-甲氧基-β-乳香酸仅在配伍比例为1:1配伍时检测到，16种化合物在乳香-没药1:1配伍时全部检测出。由此可见，乳香-没药不同配伍比例的化学成分溶出不同，且配伍比例为1:1和2:1时溶出化学成分种类最为丰富，成分含量最高或较高。提示，中药配伍其功效物质基础不是两者化学成分的简单相加，而是两药在提取过程中相互作用的结果，与其相应的临床适应病症及生物效应密切相关。
研究报道发现[13-17]，乳香、没药均具有明显的镇痛，抗炎，抗胃溃疡，抗肿瘤等作用，且乳香-没药1:1配伍时抗无水乙醇致溃疡的疗效最佳[18]。乳香-没药1:1配伍后，电导率增加，汤液黏度、浊度变化较大，可能是两药配伍后增加了各成分间的溶出度，以达到协同增效的作用[2]。乳香-没药配伍前后其化学成分溶出不同，课题组前期研究发现[6-8]，乳香-没药配伍前后，有些化合物溶出增加，有些成分溶出下降，其作用趋势并无一致性，表明两药配伍协同增效的作用机理可能与化学成分溶出变化有关。乳香-没药1:1配伍后对抑制血小板聚集、抗凝血酶活性表现为协同增效作用[4]。而乳香-没药不同比例配伍的化学成分溶出不同，可能与不同配伍比例的协同增效强度不同有关。本研究结果为进一步阐明乳香-没药配伍的量效关系和指导临床用药提供了一定的参考，其配伍比例与生物效应的相关性研究尚需进一步结合现代药理学、分子生物学、代谢组学等进行深入研究。
| [1] |
李俊, 蒋庚太. 《医学衷中参西录》应用乳香、没药探析[J]. 中医文献杂志, 2001, 1: 19. LI J, JIANG GT. Application of frankincense and myrrha in Yixue Zhongzhong Canxi Lu[J]. J Chin Med Lit, 2001, 1: 19. |
| [2] |
陈婷, 宿树兰, 钱叶飞, 等. 乳香-没药配伍前后汤液理化参数变化与化学成分的关联分析[J]. 中成药, 2012, 34(8): 1529. CHEN T, SU SL, QIAN YF, et al. Association analysis between the physiochemical parameters and the chemical constituents in Olibanum and Myrrha decoction before and after combination[J]. Chin Tradit Pat Med, 2012, 34(8): 1529. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2012.08.026 |
| [3] |
王艳艳, 王团结, 宿树兰, 等. 乳香、没药药对配伍挥发油成分的GC-MS分析[J]. 现代中药研究与实践, 2011, 25(2): 31. WANG YY, WANG TJ, SU SL, et al. Study on chemical constituents of volatile oils in drug pair of frankincense and myrrh by GC-MS[J]. Res Pract Chin Med, 2011, 25(2): 31. |
| [4] |
蒋海峰, 宿树兰, 欧阳臻, 等. 乳香、没药提取物及其配伍对血小板聚集与抗凝血酶活性的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(19): 160. JIANG HF, SU SL, OUYANG Z, et al. Effect of extracts from Olibanum and Myrrha and their compatibility on platelet aggregation and antithrombin activity[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2011, 17(19): 160. DOI:10.3969/j.issn.1005-9903.2011.19.046 |
| [5] |
宿树兰, 王团结, 段金廒. 常用树脂类药材资源分布及化学成分与药理活性研究进展[J]. 国际药学研究杂志, 2009, 36(2): 109. SU SL, WANG TJ, DUAN JA. Distribution,chemical components and bioactivity of resinherbs:research advances[J]. Int J Pharm Res, 2009, 36(2): 109. |
| [6] |
陈婷, 宿树兰, 段金廒, 等. 乳香-没药配伍前后化学成分溶出变化及其对LPS-诱导的巨噬细胞产生NO的影响[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(2): 179. CHEN T, SU SL, DUAN JA, et al. Change in dissolution of chemical components of frankincense-myrrh before and after their compatibility and effect on NO release of LPS-induced macrophage cells[J]. China J Chin Mater Med, 2013, 38(2): 179. |
| [7] |
项想, 潘承蓉, 高茹梦, 等. 基于UPLC-TQ/MS联用技术分析乳香配伍没药后对乳香中化学成分溶出的影响[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(4): 590. XIANG X, PAN CR, GAO RM, et al. Dissolution of the chemical components in combination of frankincense with myrrha based on UPLC-TQ/MS method[J]. Chin J Pharm Anal, 2018, 38(4): 590. |
| [8] |
唐于平, 束晓云, 李伟霞, 等. 药对研究(Ⅰ)-药对的形成与发展[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(24): 4185. TANG YP, SHU XY, LI WX, et al. Research on Chinese medicine pairs(Ⅰ)-their formation and development[J]. China J Chin Mater Med, 2013, 38(24): 4185. |
| [9] |
文乐兮, 魏飞跃. 方剂中药物量-效-毒关系的研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2009, 15(5): 84. WEN LX, WEI FY. Relationship among dosage,effect and toxicity of the ingredients in a Chinese herbal formula[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2009, 15(5): 84. DOI:10.3969/j.issn.1005-9903.2009.05.030 |
| [10] |
宋姚屏, 李昆, 吴孟旭, 等. 方剂量效关联的现代研究方法概述[J]. 辽宁中医杂志, 2006, 33(10): 1256. SONG YP, LI K, WU MX, et al. Overview of modern research methods of formula's function and dosage association[J]. Liaoning J Tradit Chin Med, 2006, 33(10): 1256. DOI:10.3969/j.issn.1000-1719.2006.10.023 |
| [11] |
唐于平, 段金廒, 郭盛, 等. 药对量效关系研究的认识与思考[J]. 南京中医药大学学报, 2009, 25(1): 21. TANG YP, DUAN JA, GUO S, et al. Speculations on relationship between dosage and effect of prescriptions[J]. J Nanjing Univ Chin Med, 2009, 25(1): 21. DOI:10.3969/j.issn.1000-5005.2009.01.006 |
| [12] |
李伟霞, 唐于平, 刘立, 等. 药对研究(Ⅲ)-药对的功效物质基础[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(24): 4196. LI WX, TANG YP, LIU L, et al. Research on Chinese medicine pairs(Ⅲ)-their bio-active components[J]. China J Chin Mater Med, 2013, 38(24): 4196. |
| [13] |
郑杭生, 冯年平, 陈佳, 等. 乳香没药的提取工艺及其提取物的镇痛作用[J]. 中成药, 2006, 24(11): 956. ZHENG HS, FENG NP, CHEN J, et al. Extraction process of frankincense myrrha and its analgesic effect of extracts[J]. Chin Tradit Pat Med, 2006, 24(11): 956. |
| [14] |
赵小勇, 邹全明, 郭刚, 等. 乳香胶治疗幽门螺杆菌感染的实验研究[J]. 中国药业, 2006, 15(14): 6. ZHAO XY, ZOU QM, GUO G, et al. Experimental study on mastic gum therapy for Helicobacter pylori infection[J]. China Pharm, 2006, 15(14): 6. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2006.14.004 |
| [15] |
肖娟, 刘选明, 颜冬兰, 等. 乳香挥发油抑制人肝癌SMMC-7721细胞株增殖及诱导凋亡的作用[J]. 中国天然药物, 2007, 5(1): 68. XIAO J, LIU XM, YAN DL, et al. Effects of Boswellia carterii volatile oils on proliferation and ppoptosis of liver cancer cell SMMC-7721[J]. Chin J Nat Med, 2007, 5(1): 68. |
| [16] |
周昆, 朱桃桃, 马志会, 等. 乳香没药对细胞色素P450活性的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(22): 131. ZHOU K, ZHU TT, MA ZH, et al. Influence of olibanum and myrrha on activity of cytochrome P450[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2011, 17(22): 131. |
| [17] |
谈英, 徐鑫, 周昆, 等. 乳香没药及其提取物对大鼠肝毒性的实验研究[J]. 中国药物警戒, 2010, 7(4): 193. TAN Y, XU X, ZHOU K, et al. The study on hepatotoxicity of mastic and myrrha in rats[J]. Chin J Pharmacovigil, 2010, 7(4): 193. DOI:10.3969/j.issn.1672-8629.2010.04.001 |
| [18] |
张朋, 马骏, 宋薇, 等. 乳香没药药对不同配比对无水乙醇致小鼠胃溃疡的保护作用[J]. 甘肃中医学院学报, 2009, 26(1): 12. ZHANG P, MA J, SONG W, et al. Effect of different matching of frankincense and myrrh on resisting gastric ulcer in mice induced by absolute ethyl alcohol[J]. J Gansu Coll Tradit Chin Med, 2009, 26(1): 12. DOI:10.3969/j.issn.1003-8450.2009.01.006 |